材料和试剂

植物材料：来自W64A纯近交系的玉米植物
乙醇绝对梯度HPLC级（Scharlau，S.A.UN1170）
1.0微米金微载体（Bio-Rad Laboratories，目录号：165-2263）
破裂盘900psi（Bio-Rad Laboratories，目录号：165-2328）
大载体（Bio-Rad Laboratories，目录号：165-2335）
停止筛（Bio-Rad Laboratories，目录号：165-2336）
具有维生素（Duchefa，目录号：M0222）的Murashige和Skoog培养基（M& S）
亚精胺游离碱（Sigma-Aldrich，目录号：S-2626）
次氯酸钠，5-9％Cl活性溶液（Carlo Erba，目录号：CH0223）
细胞培养皿60mm×15mm样式处理的聚苯乙烯（Corning Inc.，目录号：430166）
X-GlcA三水合钠（Duchefa，目录号：X-1406）
X-葡萄糖醛酸苷：5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖醛酸钠盐3H 2 O
用于光谱的N，N-二甲基甲酰胺（Merck KGaA，目录号：102937）
MUG：4甲基伞形基-β-D-葡萄糖醛酸苷水合物C（Sigma-Aldrich，目录号：M9130）
六氰基铁酸钾（III）（Merck KGaA，目录号：104973）
六水合氰酸铁（II）三水合物（Merck KGaA，目录号：104984）
4-甲基伞形酮钠盐（4-MU）（Sigma-Aldrich，目录号：M-1508）
荧光素酶测定试剂（Promega Corporation，目录号：E1500）
CDTA：反式-1,2-二氨基环己烷-N，N，N'，N'-四乙酸（Sigma-Aldrich，目录号：D0922）
蛋白质测定染料试剂浓缩物（Bio-Rad Laboratories，目录号：500-0006）
组织化学分析检测缓冲液（参见配方）
荧光裂解缓冲液（参见配方）
荧光分析反应缓冲液（参见配方）
荧光分析停止缓冲液（参见配方）
MSO介质（参见配方）
1x荧光素酶裂解缓冲液（参见配方）

设备

BIORAD PDS-1000/He系统（Biolistic Delivery Systems）
层流柜Telstar AH-100
真空泵Telstar 50/60 Hz
气缸压缩氦气（UN1046）117 Kg（LYNDE）
RAYPA浴水超声仪50 W
MINI-SECOEUR IKA MS2小型支架，可同时搅拌不同的Eppendorf管子
MiniSpin eppendorf离心机
ND-1000分光光度计（NanoDrop）
Spectra Max M3设备（bioNova cientifica S.L.）
Olimpus立体显微镜SZX16
附带O型圈帽和锥形底座的螺旋圆柱聚丙烯微型管（Sarstedt，目录号：72.693.105）

程序

胚胎切除从玉米核
1. 淹没并在手工授粉后16-18天洗涤玉米穗（dap）在不同的溶液中如下在室温下连续：
  1. 用乙醇96％洗脱1分钟。舍弃。
  2. 用25％次氯酸钠洗涤10分钟。舍弃。
  3. 5分钟无菌水（×3次）。舍弃。
2. 分离谷物用手套的手从被洗涤的耳朵和胚胎从谷物在无菌培养皿玻璃皿中的无菌切割器的帮助下。将9个胚胎/培养皿置于细胞培养中心的3×3阵列中（60mm直径），含有MSO培养基。胚轴侧接触介质。操作在层流下进行内阁。
3. 在黑暗中将培养皿在21-23°C保持24小时在轰击之前允许胚胎被恢复切除治疗。所描述的条件已经显示不改变研究的玉米胚胎的胚胎发生程序（Jose-Estanyol等人，2012）。
微载体原液制备（在室温下）
1. 加 1ml乙醇（HPLC）至60mg的金微载体连接环帽和锥形底座的微管。以2200rpm旋转用minishaker 10分钟。避免使用水合物乙醇。
2. 在MiniSpin Eppendorf离心机中以10,000rpm离心1分钟
3. 用移液管除去乙醇，不除去微载体沉积物。弃去乙醇。
4. 加入1ml无菌水。涡旋1分钟。如步骤2-b中的离心沉淀。弃去水（重复3次）。
5. 将微载体悬浮在1ml水中。涡旋1分钟。从均匀悬液中取等分试样（30μl）在锥形管中
6. 储存于-20°C。
用感兴趣的质粒DNA包被的微载体
1. 量化 DNA储备液（通过使用商业质粒制备试剂盒制备）通常将共享研究的启动子的质粒与基因报道子融合 β-葡萄糖醛酸酶，用纳米分光光度计。
2. 超声处理解冻的微载体等分3分钟在浴水超声波仪
3. 成功添加到微载体等分试样：
  12.5μl在TE缓冲液中的DNA（1μg/μl）
  95微升水
  125μlCaCl 2 2.5M（同时涡旋：打开管并降低速度以避免样品在添加溶液时丢失）
  25微升亚精胺0.1M（同时涡旋）
4. 涡旋3-5分钟。
5. 允许在冰上沉淀，以使乙醇蒸发最少15-20分钟
6. 如步骤2-c所述，丢弃溶液而不干扰微载体沉淀
7. 加入500μl乙醇（HPLC）。涡旋10-20秒。允许在冰上沉降15-20分钟。
8. 如步骤2-c中那样丢弃乙醇。
9. 用200μl乙醇（HPLC）重复。
10. 如步骤2-c中那样丢弃乙醇。
11. 最后加入40μl乙醇（HPLC）
12. 在浴水超声仪中超声3秒（重复3次）。
13. 涡旋3分钟。
14. 分发 40微升DNA包被的微载体在乙醇中的均匀溶液（HPLC）（步骤3-j）在三个大载体的表面中心之间（≈ 10微升/大载体）在平坦的水平表面上。大载体已经在70％乙醇中洗涤并预先干燥。让干。这将允许对三种不同样品（三种细胞培养皿，每个在MSO培养基中有9个胚胎）
15. 当微载体有在大载体表面（5-10分钟）上干燥，引入它们内部以前高压灭菌的宏载体持有人和准备好用于玉米胚胎轰击

玉米胚16-18 dap粒子轰击

洗用70％乙醇终止筛和破裂盘。位于适配器的停止屏和宏载体托架微载体附着于大载体。找到爆破片加速管的末端。
继续用MSO中的玉米胚胎轰击细胞培养皿培养基中包被有不同研究的质粒的微载体遵循PDS-100/He系统说明（ http://www.Bio-Rad.com/biolostics）。

Bombardement参数如下：

间隙距离	1.0厘米
宏载波旅行距离	1.5厘米
目标距离	9.5厘米
金微载体	1.0微米
相机部分真空	0.1 atm
破裂盘	900 psi
调压器氦气压力	1,100 psi

后轰击和在定量荧光或组织化学之前分析，将培养皿在黑暗中在21-23℃孵育24小时 h以允许报告基因的表达。荧光测定法非常有用的强启动子，但对于低或中等，组织化学分析可以更灵敏和避免稀释信号（主要存在于盾片第一细胞层中轰击胚，穿透深度）。在组织化学分析更好量化可以实现当数量和直径两者蓝色斑点（参见图1）被量化（例如：十二基本的单位为直径80μm的点，六个基本单位为40 μm直径，3个基本单位用于20μm直径和一个基本的点单位用于直径小于20μm的点）。
的结果的有效性通过结果的再现性进行评价。这通过不同实验（3至4）和的平均值来实现它们的标准偏差
最后有显着差异在构建体或条件之间（
不同在不同的玉米品种中观察到效率。效率已显示与盾片水合水平的逆相关胚胎发育过程中不同玉米品种的程度

定量组织化学分析
1. 胚胎从每个轰击的皿转移到具有1的2ml eppendorf管 ml组织化学分析检测缓冲液并温育过夜在37℃。
2. 不同强度的蓝色斑点显示为产物衍生物反应的沉淀结果，见图 1-2（通过使用氧化催化剂，该反应大大增强例如铁氰化钾/亚铁氰化钾混合物）
3. 至避免蓝色斑点扩散到胚胎表面，他们转移到50％甘油水溶液中。蓝点是通过用OLYMPUS立体显微镜SZX16观察来定量。染色的胚胎在4℃贮存
4. 作为控制一套胚胎可以用单子叶植物的组成型启动子轰击，例如作为 OsActine：GUS-nos ter ，以便轻松评估其效率微载体批次和每个具体实验
5. 组织化学分析实例：
  
  图1.用具有中低表达水平的启动子轰击的玉米胚胎
  
  图2.用OsActine :: Gus-nos 组成型强启动子轰击的玉米胚胎组 >
定量荧光分析
1. 将来自每个轰击的皿的胚胎在液体N 2中冷冻并储存在-80℃直至分析。
2. 将来自轰击皿的9个冷冻胚胎在300μl荧光裂解缓冲液中研磨
3. 在MiniSpin Eppendorf离心机中在4℃下离心15分钟13,000rpm
4. 冻结澄清的提取物溶液在-80℃下等分40μl，直到 β-葡萄糖醛酸酶定量。泥沙被拒绝。
5. 对于荧光分析，将20μl纯净的提取物加入到80μl荧光分析反应缓冲液中并在37℃温热。
6. 在不同的时间进程（10（零），60,180,360分钟）取20μl的等分试样
7. 反应通过加入180μl荧光测定分析终止缓冲液加入到每份取出的等分试样中，并保存在4℃直至分析
8. 样品转移到微量滴定板以测量荧光发射的β-葡萄糖醛酸苷酶产物4-MU（4-甲基伞形酮）板荧光分析仪，Spectra Max M3 apparatu（激发365nm，发射455nm）
9. 分析后，解冻样品不能重新冷冻并丢弃
10. 4-甲基伞形酮（4-MU）标准品用于校准系统
11. 蛋白使用Bradford测定法测定提取物中的浓度 Spectra Max M3设备。
荧光测定研究中的内部控制，建议两个不同的内部控制
1. 样品被融合到a的荧光素酶酶的构建组成型启动子作为玉米泛素（pUBI :: LUC-nos-ter）来控制在实验中不同样品的同质轰击。
  1. 冻结胚胎在液氮中24小时轰击后，研磨所有冷冻组织粉末并通过匀浆在300μl重悬将荧光素酶裂解缓冲液（1x）预先温热至室温
  2. 沉淀通过用MiniSpin在13,000rpm下短暂离心来产生碎片 Eppendorf离心机在4°C，并将上清液转移到新管。在冰上保持分析。
  3. 混合10微升细胞裂解液用100μl的荧光素酶测定试剂在微量滴定板和快速测量Spectra Max M3设备中产生的光。
  4. 使40μl等分试样剩余的提取物并在-80℃下冷冻。然后从步骤6-e进行到进行研究的启动子的荧光分析
2. 或者，可以用两种混合物来轰击样品表达两种玉米互补转录的构建体因子，玉米 myb因子C1 （<35> :: I-C1 ）和 myc因子B-秘鲁 IB-Peru）参与花青素生物合成。在这些构造这些因素的表达受到控制花椰菜花叶病毒（CAMV）35S组成型启动子和第一个内含子增强子的玉米Adh1（醇脱氢酶1 ）。两种因子的表达导致表面上的红色/青铜斑点可以通过观察用肉眼观察比较的胚胎立体显微镜。然后从步骤6-a开始进行荧光测定研究的启动子的分析。

食谱

组织化学分析检测缓冲液（10ml）
1ml磷酸钠1M（pH8.0） 27mg（终浓度5mM）六氰基铁酸钾（III）
21mg（终浓度5mM）六氰基铁酸（II）钠 6微升Triton X-100 1.5ml来自储备液的X-Gluc（在N，N-二甲基甲酰胺中为20mg/ml）
荧光裂解缓冲液
50mM磷酸钠（pH7.0） 10mM EDTA（pH8.0） 10mM BME（β-巯基乙醇） 0.1％SDS（v/v）
0.1％Triton X-100（v/v）
荧光分析反应缓冲液（4ml）
3ml裂解缓冲液
1 ml甲醇
1,764 mg MUG
停止缓冲液的荧光分析
0.2M Na 2 CO 3 sub。
MSO培养基（1L）
4.5g具有维生素（pH 5.8，KOH 1M）的M& S培养基 30克蔗糖 2.4克Gelrite
1x荧光素酶裂解缓冲液
25mM Tris-磷酸（pH7.8）
2mM DTT
2mM CDTA：1,2-二氨基环己烷-N，N，N'，N'-四乙酸
10％甘油 1％Triton ^？ X-100

致谢

该协议改编自Jose-Estanyol和Puigdomenech（2012）。

参考文献

Jose-Estanyol， M.和Puigdomenech，P。（2012）。细胞定位来自Zea mays的胚胎特异性杂交PRP，和表征启动子调节元件的基因。植物分子生物学（Plant Mol Biol）80（3）：325-335。