材料和试剂

新生小鼠
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Life Technologies，目录号：14040-091）
Hank's平衡盐溶液（HBSS）（Life Technologies，目录号：14170-088）
Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）（Life Technologies，目录号：61965-026）
Ham's F-12营养混合物（F12）（Life Technologies，目录号：31765-027）
胰蛋白酶（Sigma-Aldrich，目录号：T5266）
胰岛素（Sigma-Aldrich，目录号：I1882）
全血运铁蛋白（Sigma-Aldrich，目录号：T0665）
腐胺（Sigma-Aldrich，目录号：P5780）
孕酮（Sigma-Aldrich，目录号：P8783）
亚硒酸钠（硒）（Sigma-Aldrich，目录号：S5261）
青霉素 - 链霉素（Life Technologies，目录号：15140-130）
胎牛血清（FBS）（Life Technologies，目录号：10106-169）
B27（Life Technologies，目录号：17504-044）
rhFGFbasic（Peprotech，目录号：167100-18B-B）
rhEGF（Peprotech，目录号：167AF-100-15A）
神经球定义为中等（见配方）
胰蛋白酶（见配方）

设备

Sterilin通用容器（Thermo Fisher Scientific，目录号：128A/P）
标准TC BD Falcon 60mm细胞培养皿（BD Biosciences，Falcon ，目录号：353002）
Vibratom（Microm，型号：HM450）
立体显微镜
细胞培养罩和孵化器
剪刀，细镊子，刮刀，微刀
冰桶
火抛光玻璃巴斯德移液器
水浴

程序

从新生小鼠解剖大脑。
在冰冷PBS中，用Vibratom切割400μm厚的冠状切片（图1A）（从嗅球到侧脑室的前角）。保持每个大脑的前两个部分包含侧脑室的侧壁，并将其放在冰冷的HBSS。

图1.新生小鼠SubVentricular区的解剖。 A。插图的新生小鼠矢状断面显示切割窗口时，使用vibratome。 B.冠状切面显示解剖隔离侧脑室组织的部分。 C.在1周长的培养后获得的神经球。比例尺，500μm。
在显微镜下，解剖侧脑室的侧壁（图1B）。用一只手拿一把镊子处理切片，并保持在菜的底部，一个微刀与另一个切出感兴趣的区域。在每次解剖后丢弃切片的其余部分。
用无菌微刀将组织切成小立方体（400μm立方体）
移取组织在800微升HBSS体积内，并将其放置在30毫升Sterilin通用容器。加入200微升胰蛋白酶12.5毫克/毫升。在37℃下在水浴中孵育5分钟
加入10体积的10％HBSS-FBS。使用火抛光的玻璃巴斯德吸管，轻轻地吸取上下帮助离解。定期取液滴，并在显微镜下检查分离是否完全
在室温（RT）下以800×g离心7分钟，弃去上清液，并将沉淀重悬于10ml新鲜HBSS中。取样品并计数细胞数。
将细胞悬液在800×g离心7分钟，弃去上清液，并将其悬浮在标准TC BD Falcon 60mm细胞培养皿中，浓度为25,000细胞/ml，在神经球定义培养基中，补充与2％B27，bFGF（20ng/ml）和EGF（20ng/ml）
每3天，加入半量的双重补充的[4％B27，bFGF（40ng/ml）和EGF（40ng/ml）]神经球定义培养基。为了避免任何球体附着到培养皿的底部，不要将培养物延伸超过1周（图1C）。

食谱

神经球定义为中等
DMEM/F12,3:1体积，分别为
5μg/ml胰岛素 100μg/ml全转铁蛋白 100米腐胺
20 nM孕酮
30nM硒
1％青霉素 - 链霉素（分别为100IU/ml和100μg/ml）
胰蛋白酶（每次准备一份新的等分试样）
将12.5mg胰蛋白酶溶解在1ml冰冷的HBSS中

致谢

该协议改编自Durbec和Rougon（2001）和Vernerey等人（2013）。

参考文献

Durbec，P。和Rougon，G。（2001）。将哺乳动物嗅觉祖细胞移植到雏鸡宿主中揭示了依赖于细胞承诺的迁移和分化潜能。 Mol Cell Neurosci 17（3）：561-576
Vernerey，J.，Macchi，M.，Magalon，K.，Cayre，M。和Durbec，P。（2013）。睫状神经营养因子控制成年啮齿动物脑中髓鞘再生期间的祖细胞迁移。 J Neurosci 33（7）：3240-3250。