图1. PTEN-脂质结合测定的关键步骤

材料和试剂

设备

程序

在2:1:0.8的氯仿：甲醇：水的溶液中重构冻干脂质以制备所需的储备液（构成所有脂质以制备1mM的储备液）。
稀释脂质以获得所需的工作浓度（使用的工作浓度为1nM）
将1nM的脂质稀释液点在Hybond C-extra硝酸纤维素膜上（每个斑点间隔约1cm）。
在室温（RT）下干燥1小时
孵育膜与缓冲摇摆在封闭缓冲液中1小时在室温
在4℃下孵育膜过夜，在含有20-100nM GST-融合蛋白（或其他表位标记的蛋白质）的新鲜封闭缓冲液中轻轻摇动。
在TBST中用50分钟清洗膜10次（使用足够体积的TBST，其将覆盖膜〜10ml）。
在室温下孵育膜1小时，在封闭缓冲液中用抗GST单克隆抗体1:1000稀释。
在TBST中用50分钟清洗膜10次
孵育膜1小时与1：10,000稀释的HRP共轭抗小鼠二抗在封闭缓冲液室温。
在TBST中用60分钟清洗膜12次
根据制造商的说明，通过ECL检测与膜结合的脂质结合蛋白（参见图2）

图2.表示PNUTS对PTEN的脂质结合性质的影响的印迹。用磷脂酰丝氨酸（PS）或磷脂酰乙醇胺（PE）或磷脂酰胆碱（PC）或PS点样的硝化纤维素膜： PE：PC混合物（1：1：1）一式三份与指定的重组蛋白一起孵育。用抗GST抗体（改编自Kavela等人，2013）检测结合的PTEN。

食谱

致谢

该协议改编自Kavela等人（2013）。

参考文献

Kavela，S.，Shinde，SR，Ratheesh，R.，Viswakalyan，K.，Bashyam，MD，Gowrishankar，S.，Vamsy，M.，Pattnaik，S.，Rao，S.，Sastry，RA，Srinivasulu，M 。，Chen，J.and Maddika，S。（2013）。 PNUTS通过螯合PTEN起到原癌基因的作用。 Cancer Res 73（1）：205-214。