材料和试剂

宿主植物（
Brassica oleraceae 和拟南芥）
真菌分生孢子（ Alternaria Brassicicola ）
马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）
Miracle-Gro（The Scotts Company LLC，U.S.A。）它是一种氮基肥料。任何肥料都会工作
具有30ng/ml潮霉素B的PDA（参见配方）

设备

离心机（Eppendorf，型号：5180R或等同物）
喷水瓶
血细胞计数器
无菌50ml带螺帽的管子
用于50毫升管的管架
Miracloth（Calbiochem，目录号：475855）
用于过滤分生孢子的漏斗
用于分生孢子的玻璃"曲棍球棒"
培养皿
培养皿
荧光灯，30W家用灯

程序

宿主植物的制备
1. 填充塑料罐（3英寸x 3英寸）混合半局部土壤和半市售盆栽混合物; 用手推或用平板推上顶部包装土壤。
  注意：不要对土壤混合物进行高压灭菌。
2. 将含有土壤的24盆放在塑料托盘中，底部有小排水孔。用自来水轻轻地用水浸泡土壤。温和的喷洒将防止土壤溅出锅。让多余的水从土壤排出约2小时。
3. 使用棍子在每个盆的土壤中做一个约1厘米深的洞。
4. 将一种可商购的（例如，Jonny's，Winslow，ME）绿白菜（ Brassica oleracea ）放入孔中并用土壤覆盖。对于拟南芥（Arabidopsis thaliana），在土壤上撒播几粒种子，然后喷洒水;在生长期间逐渐从每个花盆中除去一株植物
5. 将盆在室温下在荧光灯下，14小时光照，10小时黑暗周期为绿白菜，和10小时光，14小时黑暗周期为拟南芥。种子将需要大约一个星期在室温下发芽。如果托盘覆盖有半透明塑料盖，它们会更快地发芽。
6. 在相同条件下生长植物5至6周。当土壤表面变干时，通过加入自来水保持土壤潮湿。
  注意：不要过度浇水，也不要将壶放在充满水的纸盒里。
7. （可选）如果4周龄以上的幼苗出现缺氮症状（老叶发黄），将1茶匙的Miracle-Gro溶解于1加仑水中。倒入约70ml的溶液或足够的量以浸泡土壤在48个盆中的每个盆中。类似的氮基肥料也会产生类似的效果
A-1（选项1 ）分离叶测定。生物测定比完整植物更容易分离叶。容易接种和测量分离的叶上的病变的尺寸。此外，该方法需要较少的空间比其他方法。
1. 选择类似高度的6周龄白菜植物，并且对于每个测定具有相似大小的叶。从茎的第4个至第8个位置收获健康叶，从底部开始计数。
2. 放置两块纸巾覆盖在直径150mm，高15mm的培养皿的底部。用去离子水浸泡圆盘，形成微湿室
3. 通过喷雾瓶中的水喷雾除去每片叶子的蜡质表面。不要用裸手触摸叶子的表面，这会导致比野生型更大的病变。此外，基因的非致病突变体在我们以前的工作中变得致病。将叶子放在微湿室中并随机排列在实验台上用于测定。
4. 接种后，用盖子盖住培养皿以保持相对湿度接近100％。
  注意：该测定可以用各种白菜种和品种进行。然而，拟南芥的叶子对于该程序太薄。
A-2（选项2 ）全植物测定。我没有遇到任何突变体显示在分离的叶和整株植物之间的生物测定的结果的显着差异。然而，我预计识别具有显示不同结果的突变体的基因。我建议对分离的叶子进行三次测定，对整株植物进行两次。
1. 将半透明塑料槽（90厘米×50厘米×50厘米或类似尺寸）与水浸泡的纸巾在一起，并用水将槽的内壁喷雾。
2. 将盆栽植物放在塑料槽中。任何 Brassica 物种或生态型。 thaliana 适用于整株植物检测
3. 接种后，用塑料包封槽和植物以保持相对湿度接近100％。塑料包装可以在大多数杂货店购买。保持槽和植物在室温下大约一个星期，定期观察病变发展
接种准备
1. 对每一个菌株进行两轮单孢子分离。 brassicicola 。收获分生孢子从第二次单孢子分离在〜3毫升20％甘油。分配50μl的甘油加分生孢子（分生孢子的甘油原液）到1.5ml等分试管中。冷冻并保持甘油原液在-80℃直到使用。从生物安全柜中的PDA平板收获分生孢子，以保护研究人员和防止环境污染。
2. 在生物安全柜中，用适当的选择试剂将10μl甘油原液转移到新鲜的PDA板上
3. 在黑暗中在25℃在生长室中孵育平板5天。这可以在室温下在不透光的纸板盒中进行。
4. 在生物安全柜中，向每个板中加入5ml无菌水，并用灭菌的玻璃曲棍球棒轻轻地擦拭分生孢子垫。如果分生孢子轻轻释放，气生菌丝不会污染分生孢子悬浮液，您可以直接进行下一步。然而，如果悬浮液含有太多菌丝碎片或分生孢子的链或簇，则需要通过一层Miracloth或奶酪布过滤悬浮液，直到大部分被除去。此步骤可以使用漏斗。
5. 将3-5毫升悬浮在水中的分生孢子转移到带有盖子的50ml锥形管中。用无菌水填充管。
6. 以3,000 rpm离心管子5分钟。如果离心机不可用，离开管在台上，直到分生孢子沉淀。大约需要15分钟。
7. 用50ml新鲜无菌水替换水，并在3,000 rpm离心5分钟。浮动水可以通过排水或移液除去。管可以通过小心地倾倒50ml水来填充。
8. 使用血细胞计数器在显微镜下计数分生孢子。在装载血细胞计数器之前，必须严格搅拌分生孢子悬浮液。
9. 重复步骤B-6。
10. 在1ml水中将分生孢子浓度调节至2×10 5。计数孢子数以确认浓度。这是一个耗时的过程，需要经验。大致的孢子计数通常足以鉴定致病性所需的基因或极大地影响毒力。毒力变化的准确量化需要精确的孢子计数。致病性因子突变体通常是非致病性的，而不管分生孢子的数目
11. 用野生型A的分生孢子悬浮液（10μl水中的2,000个分生孢子）直接接种每片叶子的右侧。 brassicicola和相同叶的左侧，在10μl水中具有2,000个分生孢子的实验突变株。该方法以对称方式在中心静脉的两侧对准对照和实验样本。重要的是经常搅拌接种物或者病变大小的内部变化将增加。不要在接种前做伤口。源于三株植物的九株叶足以产生统计学上稳定的结果。我建议至少三轮生物测定，以获得可靠和一致的结果。植物条件和分生孢子的年龄是影响测定结果的重要因素
12. 用水喷洒培养皿盖的内部并盖住培养皿
13. 孵育整个植物在塑料槽或分离的叶子培养皿中接种真菌菌株，在室温下5天。保持光照和黑暗循环类似于用于植物生长的循环。
14. 在接种后5天测量病变直径。使用公式计算每个突变体相对于野生型的毒力（Σ（Dm i）-Dw i）/Σ（Dw i，i））×100，其中Dw em i是由第i个样本的野生型产生的病变直径，D m，i是所创建的病变直径对于 i 样品的突变体
15. 使用各种统计学方法，例如在Excel中或在统计分析系统（SAS Institute，Inc。）中的Student方差（ANOVA）的Student方差分析（ANOVA），在野生型和突变体之间分析损伤大小， Cary，NC）。

食谱

PDA与30ng/ml潮霉素B
将19.5g马铃薯葡萄糖琼脂加入500ml水中
摇匀并混合粉末并高压灭菌20分钟
将PDA肉汤冷却至50℃
加入300微升50毫克/毫升潮霉素B，并混匀
倒入90 mm x 15 mm培养皿

致谢

该协议改编自以前发表的论文（Cho等人，2013; Cho等人，2012; Srivastava等人，2012年））。

参考文献

Cho，Y.，Ohm，R.A.，Grigoriev，I.V.and Srivastava，A。（2013）。真菌特异性转录因子AbPf2在链格孢菌中激活致病性。 Plant J 75（3）：498-514。
Cho，Y.，Davis，JW，Kim，KH，Wang，J.，Sun，QH，Cramer，RA，Jr.and Lawrence，CB（2006）。使用线性最小元件（LME）构建体的链格孢菌（Alternaria brassicicola）功能性基因组学的高通量靶向基因破坏方法。 Mol Plant Microbe Interact 19（1）：7-15。

Cho，Y.，Srivastava，A.，Ohm，R.A.，Lawrence，C.B.，Wang，K.H.，Grigoriev，I.V.and Marahatta，S.P.（2012）。转录因子Amr1在链格孢菌中诱导黑色素生物合成并抑制毒力。 PLoS Pathog 8（10）：e1002974。

Srivastava，A.，Ohm，R.A.，Oxiles，L.，Brooks，F.，Lawrence，C.B.，Grigoriev，I.V.and Cho，Y.（2012）。锌指家族转录因子AbVf19是诱导重要基因子集所必需的在链格孢菌中。 Mol Plant Microbe Interact 25（4）：443-452。