图1.我们的方法的流程图

材料和试剂

质粒/核酸

质粒pSU32（ http：//www.iac.saga-u。 ac.jp/lifescience/su32/index.htm ）（图2）

图2.质粒pSU32
E。包含Amp ^r基因（ bla基因）（例如，pUC，pBluescript和其他许多类型常用质粒载体）
要克隆的DNA片段

PCR引物（用于制备转化盒SU32的pSU30-14和pSU30-23对，以及用于制备待克隆的DNA片段的引物对）

用于制备转化盒SU32的引物对
pSU30-14	5'-CAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTG-3'
pSU30-23	5'-ATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGA
	AGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACT-3'
示例：用于制备要克隆的DNA片段的引物对（在这种情况下，将GFPuv 基因克隆到pUC19质粒中。将交叉区域（待连接的序列加下划线）。
pUCGFPF	5'-GAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATG GCTAGCA
	AAGGAGAAGAACT-3'
pUCGFPR	5'-TTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAG TTATTTG
	TAGAGCTCATCCA-3'

套件
1. （可选）PCR纯化试剂盒
  在我们的论文（Goto和Nagano，2013）中，我们使用MonoFas DNA纯化试剂盒I（GL Sciences，Tokyo，Japan）。然而，这个套件目前在我们的实验室中不能很好地工作。相反，我们现在使用NucleoSpin凝胶和PCR清理工具包（MACHEREY-NAGEL，Düren，德国）。
2. 用于大肠杆菌的质粒DNA纯化试剂盒
  我们使用了Mini-M质粒DNA提取系统（Viogene，台北，台湾）（Goto和Nagano，2013）。
3. 悬浮缓冲液（在Mini-M Kit的情况下，我们使用200μlMX1缓冲液）
酶
1. 校对DNA聚合酶如Prime STAR GXL DNA聚合酶（TAKARA BIO，Ohtsu，Japan）
2. 限制酶（New England Biolabs）
细胞
1. 酵母细胞（通常使用的含有基因型 trp1 的菌株，如YPH499）
2. 电容性大肠杆菌细胞
  我们使用大肠杆菌 HST08 Premium Electro-Cells（TAKARA BIO，Ohtsu，Japan）（Goto和Nagano，2013）。然而，这些细胞目前在我们的实验室中不能很好地工作。相反，我们现在根据分子克隆（4 ^th版，第177-182页）制造电子竞争细胞。
板
1. 含有100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂（Molecular Cloning，4版，第1100页）
2. 缺乏色氨酸的合成完整平板（The Gietz Lab，University of Manitoba， http：//home.cc.umanitoba .ca /〜gietz/或Gietz和Woods，2002）
3. 氨苄青霉素（钠盐）
其他
1. 电镀珠
2. 酸洗玻璃珠（350-500μm）
  我们自己制造酸洗玻璃珠。然而，酸洗玻璃珠（425-600μm）可以从SIGAMA-ALDRICH（目录号：G8772）获得。
3. 琼脂糖凝胶（Molecular Cloning，4版，第94-98页）
4. 酵母转化所需的材料和试剂（The Gietz Lab，University of Manitoba， http://home.cc .gitz和Woods，2002）

设备

热循环仪
琼脂糖凝胶电泳仪
离心机
可选：Picofuge
培养箱（30°C和37°C）
涡流机
可选：FastPrep FP100A（MP生物医学）
加热块（70℃）
电穿孔装置和试管
聚丙烯酰胺凝胶电泳仪
玻璃珠（350-500μm）

程序

转化盒SU32的制备
1. 使用质粒pSU32作为模板，通过PCR制备转化盒SU32。要获取此模板，请访问以下网页。
  http://www.iac.saga-u.ac.jp /lifescience/su32/index.htm
2. 对于PCR扩增，引物对是pSU30-14和pSU30-23（使用Prime STAR GXL DNA聚合酶，98℃10秒，55℃15秒和68℃75秒的40个循环）（Goto和Nagano，2013）。当我们进行PCR反应时，我们使用Prime STAR GXL DNA聚合酶，但您可以使用其他校正DNA聚合酶。
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3. 通过1％琼脂糖凝胶电泳确认扩增。扩增子大小约为2.7kb（2,651bp）（图3）
  
  图3.转换磁带SU32
线性化E的制备。大肠杆菌质粒载体
1. 摘要。通过使用限制性内切酶在交换区内的大肠杆菌质粒载体。
  注意：
  1. 所需的限制性末端可以位于载体的交叉区域内的任何地方。您可以使用平末端限制酶和粘性末端限制酶，因为限制性末端不是发生连接反应的位置。
  2. 这种大肠杆菌质粒载体必须包含Amp sup基因。
  3. 大肠杆菌质粒载体的PCR扩增是制备线性化大肠杆菌质粒载体的另一种方法。
  4. 虽然我们在论文中纯化了消化的质粒（Goto和Nagano，2013），但这个纯化步骤不是必需的。
2. 通过1％琼脂糖凝胶电泳确认消化
3. 下图显示了限制性消化的一个实例（图4还显示了如何连接DNA片段）
  
  图4.通过EcoRI-HF和XbaI消化的pUC19
待克隆的DNA片段的制备。
1. 使用校对DNA聚合酶如Prime STAR GXL DNA聚合酶通过PCR扩增感兴趣的DNA片段。
  注意：
  1. 应设计PCR引物以携带与交换区具有超过20bp同源性的序列。我们经常使用与交叉区域具有30-40bp同源性的序列。为了最高的效率，我们建议您使用通过聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化的PCR引物。然而，PAGE纯化不是必需的。
  2. 虽然我们在论文中纯化了感兴趣的DNA片段（Goto和Nagano，2013），但这个纯化步骤不是必需的。
2. 通过琼脂糖凝胶电泳确认扩增。
将DNA片段转化到酵母中。
1. 通过TRAFO协议将这3个DNA片段转化到酵母中（Gietz和Woods，2002）。 TRAFO协议可从以下网页获得。
  http://home.cc.umanitoba.ca/~gietz/
  注意：
  1. 在我们的实验室中，我们以该方法的一半或四分之一进行转换程序。
  2. 3个DNA片段的摩尔比为1:1:1。然而，这个比例不重要（Goto和Nagano，2013）。（比率的十倍变化可能不影响效率。）转换盒SU32的需要量< 50 ng。
2. 通过将酵母细胞在缺乏色氨酸的合成完整平板上在30℃下温育2或3天来选择转化体。
从酵母中纯化质粒注意：为了从酵母中纯化质粒DNA，我们使用Mini-M质粒DNA提取系统，但是可以使用其他质粒DNA提取试剂盒用于大肠杆菌。
1. 用电镀小珠从平板上刮下所有菌落，并通过离心机收集酵母细胞。使用微量离心机，以14,000×g离心细胞5秒（我们经常使用picofuge以最大速度30秒）。除去上清液。
2. 加入悬浮缓冲液（在Mini-M试剂盒的情况下，我们使用200μlMX1缓冲液），并通过涡旋悬浮酵母细胞。
3. 使用1.5ml管将悬浮等量的酸洗涤的玻璃珠（350-500μm）加入到悬浮的溶液中，将玻璃珠加入含有悬浮溶液的管中，然后通过以速度5.5摇动3次20秒来破坏酵母细胞，使用FastPrep FP100A。或者，以最大速度涡旋5次，每次1分钟。下图显示了这些实验步骤。
4. 加入变性缓冲液（在Mini-M Kit的情况下，我们使用250μlMX2缓冲液），轻轻混合。
5. 通过针（18号）在管的底部打孔。下图显示了这些实验步骤。
6. 将另一个管附接到管的底部，并离心它们以回收在底部管中的变性溶液。下图显示了这些实验步骤。
7. 对于后续程序，请按照制造商的说明进行操作。然而，使用预热至70℃的洗脱溶液。因为洗脱溶液的DNA浓度低，所以不能通过琼脂糖凝胶电泳或分光光度计测定DNA的浓度。然而，洗脱溶液的DNA浓度足以用于下一步骤。因此，不需要洗脱溶液的冷凝。
洗脱溶液的预处理（可选）
1. 为了最高效率，通过直接将酶加入到洗脱的DNA溶液中，用少量（例如0.2μl）合适的限制酶消化5μl回收的质粒（洗脱的溶液）。
  注意：因为这个方法的原理很复杂，请阅读我们的纸（Goto和Nagano，2013）。不要添加酶反应缓冲液，因为盐可能影响下一个电穿孔步骤。
2. 在适当的温度下孵育管1小时以上。
将洗脱的溶液转化为E。大肠杆菌。
将洗脱的溶液转化为E。通过电穿孔将大肠杆菌电感受态细胞接种在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂上。
分析。大肠杆菌转化体

致谢

该协议改编自以前发表的论文，Goto和Nagano，（2013）。这项工作的一部分由来自日本科技机构（JST）的A-STEP（FS阶段）和来自日本科学促进会的挑战探索研究的助剂提供支持。

参考文献

Gietz，R.D.and Woods，R.A。（2002）。通过乙酸锂/单链载体DNA /聚乙二醇法转化酵母。方法Enzymol 350：87-96
Goto，K.and Nagano，Y。（2013）。超低背景DNA克隆系统 PLoS One 8（2）：e56530。
Iizasa，E。和Nagano，Y。（2006）。高效的基于酵母的体内多个DNA片段的DNA克隆和同时构建酵母/大肠杆菌穿梭载体。 40（1）：79-83。
Nagano，Y.，Takao，S.，Kudo，T.，Iizasa，E。和Anai，T。（2007）。通过一步转化将基于酵母的DNA片段重组到植物转化载体中。 Plant Cell Rep 26（12）：2111-2117。