材料和试剂

拟南芥植物或种子材料
液氮
100mM磷酸钠缓冲液（pH7.5）
0.5％（w/v）果胶（在dH 2 O中）（Sigma-Aldrich，目录号：P-9135）
0.1U /μl醇氧化酶（在100mM磷酸盐缓冲液中）（pH7.5）（Sigma-Aldrich，目录号：A2404）
0.5U /μl甲醛脱氢酶（在100mM磷酸盐缓冲液中）（pH7.5）（Sigma-Aldrich，目录号：F1879）
0.4mM NAD +（在100mM磷酸盐缓冲液中）（pH7.5）（Sigma-Aldrich，目录号：N8410）
PME（Sigma-Aldrich，目录号：P5400）
蛋白酶抑制剂混合物（1x）（含有100mM PMSF，2mM Bestatin，0.3mM Pepstatin A和0.3mM E-64）（abmGood，目录号：G135）
蛋白质提取缓冲液（参见配方）
主混合（见配方）

设备

程序

称重植物或种子组织（拟南芥）。每次提取使用约100mg。
使用研钵和杵将组织在液氮中研磨成细粉末。在研磨过程中组织必须保持冷冻。
向粉末中加入两倍新鲜重量（w/v）的提取缓冲液，并使粉末在缓冲液中解冻。
涡旋10秒。
将提取物在4℃下旋转30分钟，并在4℃下以11,500xg离心20分钟。
上清液是可溶性蛋白质提取物。立即使用新鲜的上清液进行PME酶测定，因为活性会受到冻结的影响
将每个样品的四个重复（每个10μl）移液到微孔板孔中。对于阴性对照，仅使用蛋白质提取缓冲液。对于阳性对照，使用市售PME在蛋白质提取缓冲液中的溶液。
将主混合物（180μl）加入到每个孔中，通过上下吹吸混合。避免形成气泡。
为了开始反应，将10μl果胶溶液加入样品，阴性和阳性对照，但不加入背景对照。通过上下吹吸混匀
立即将板放入酶标仪。如果在混合过程中形成气泡，摇动板5秒。记录在340nm的吸光度在室温下15分钟的变化。
对每个孔计算反应的线性部分每单位时间的吸收的变化，并用于计算NADH浓度的增加。使用Lambert-Beer定律计算NADH浓度，NADH（6,220M ^-1 cm ^-1）的外切系数ε<340。一个nkat PME活性定义为每秒形成1nmol NADH。
一式三份的活动平均值。

食谱

致谢

这项工作得到瑞士国家科学基金会（授予31003A_127563;结核病）和欧洲分子生物学组织（EMBO：ALTF 61-2010）和国家科学院Leopoldina Leopoldina奖学金计划（LPDS 2009-35）。

参考文献

Grsic-Rausch，S。和Rausch，T。（2004）。用于测定果胶甲酯酶活性的偶联分光光度酶测定法及其由蛋白质抑制剂的抑制作用。 a> Anal Biochem 333（1）：14-18。
Mueller，K.，Levesque-Tremblay，G.，Bartels，S.，Weitbrecht，K.，Wormit，A.，Usadel，B.，Haughn，G.and Kermode，A.R。拟南芥中细胞壁果胶的脱甲基酯化在种子萌发中起作用。 Plant Physiol 161（1）：305-316。
Wolf，S.，Mouille，G。和Pelloux，J。（2009）。 Homogalacturonan methyl-esterification and plant development。 Mol Plant 2（5）：851-860。