第I部分： ATP耗尽

材料和试剂

葡萄糖（ - ）RPMI 1640（Life Technologies，目录号：11879020）
10％胎牛血清（Life Technologies，Gibco ）
青霉素/链霉素（Life Technologies，目录号：15140-122）
谷氨酰胺（Life Technologies，目录号：25030-081）
脱氧葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：D6134）
抗霉素A（Sigma-Aldrich，目录号：A8674）
RPMI 1640（Life Technologies，目录号：31800089）
ATP消耗介质（参见配方）
IB4 LCL的培养基（参见配方）

设备

CO 2培养箱（Thermo Fisher Scientific Forma CO 2培养箱）
离心机（Eppendorf，型号：5810R）

程序

沉淀5×10 6个淋巴母细胞，并补充5ml的ATP消耗培养基。
在CO 2孵育器（37℃）孵育细胞2小时
通过以1,050rpm（220×g; Eppendorf 5810R）旋转5分钟收集细胞。
用1x PBS洗涤细胞两次，并保存进一步的实验目的

食谱

ATP耗尽培养基
葡萄糖（ - ）RPMI 1640补充：
10％胎牛血清
100U/ml青霉素/100μg/ml链霉素 2mM谷氨酰胺 2mM脱氧葡萄糖 300nM抗霉素A
IB4 LCL培养基
RPMI 1640补充：
10％胎牛血清
100U/ml青霉素/100μg/ml链霉素 2mM谷氨酰胺

参考文献

Liu， C.D.，Chen，Y.L.，Min，Y.L.，Zhao，B.，Cheng，C.P.，Kang， Chiu，S. J.，Kieff，E。和Peng，C.W。（2012）。核伴侣核糖体护送爱泼斯坦 - 巴尔病毒核抗原建立用于人B细胞中潜在感染的转录级联 Pathog 8（12）：e1003084。

第II部分：链霉亲和素 - 琼脂糖介导的DNA下拉测定

材料和试剂

DNA模板（在这种情况下：LMP1启动子报告质粒）
注意：转录LMP1启动子对EBV潜伏感染至关重要。
生物素标记的引物（Vita Genomics）
IB4淋巴母细胞（LCL）
DNA洗脱柱（Geneaid Biotech）
链霉亲和素结合的琼脂糖（Life Technologies，目录号：SA100-04）
2×SDS样品缓冲液
NP-40（Sigma-Aldrich，目录号：I8896）
胃酶抑素A（Sigma-Aldrich，目录号：P5318）
抑肽酶（Sigma-Aldrich，目录号：A1153）
亮肽素（Sigma-Aldrich，目录号：L2884）
苯基甲磺酰氟（Sigma-Aldrich，目录号：P7626）
裂解缓冲液（见配方）
蛋白酶抑制剂（参见配方）

设备

PCR产物洗脱柱（Geneaid Biotech）
离心机（Eppendorf，型号：5810R）
离心机（Eppendorf，型号：5415R）
摇臂（管旋转器）
PCR机（MJ Research，型号：PTC 200 Thermal Cycler）
凝胶电泳设备（Embi Tec，型号：RunOne ^TM电泳系统）
Western印迹设备（Bio-Rad，型号：Mini-protean 3）

程序

通过PCR扩增100μl反应体积中的生物素或非生物素标记的查询启动子的DNA片段
洗脱 PCR产物通过具有100μl洗脱的洗脱柱缓冲液，取5μlDNA（5％输入DNA）进行凝胶电泳
取1×10 7个淋巴母细胞用1ml裂解缓冲液裂解，将反应管放在摇床上在4℃孵育1小时。通过在13,200rpm下旋转收集上清液（16,100×g ; Eppendorf 5415R），4℃
添加所需生物素标记或非生物素标记的DNA上清并放置管到摇床上，并在4℃下孵育另一小时
加向每个管中加入40μl链霉亲和素结合的琼脂糖，并放入管中再次在摇杆上，并等待30分钟以允许亲和结合的链霉亲和素与生物素完成
通过在1050rpm（220×g /孔; Eppendorf 5810R）中，4℃下旋转5分钟，收获生物素标记的DNA。
洗收集链霉亲和素结合的琼脂糖珠与500μl裂解缓冲液5次，并向每个样品加入40μl2×SDS样品缓冲液使用它们进行western印迹分析

食谱

裂解缓冲液（1 L）
1％NP-40
2mM EDTA 10％甘油
50mM Tris-HCl
150mM NaCl
蛋白酶抑制剂
1μg/ml胃酶抑素A
1μg/ml抑肽酶
1μg/ml亮肽素 0.5mM苯基甲磺酰氟 *用指定的蛋白酶抑制剂补充裂解缓冲液

参考文献

Liu， C.D.，Chen，Y.L.，Min，Y.L.，Zhao，B.，Cheng，C.P.，Kang， Chiu，S. J.，Kieff，E。和Peng，C.W。（2012）。核伴侣核糖体护送爱泼斯坦 - 巴尔病毒核抗原建立用于人B细胞中潜在感染的转录级联 Pathog 8（12）：e1003084。

第三部分： ATP-agarose Mediated Pull-Down Analyses

材料和试剂

IB4 LCL细胞
腺苷5'-三磷酸 - 琼脂糖（Sigma-Aldrich，目录号：A2767-1ml）
2×SDS样品缓冲液
葡萄糖（ - ）RPMI 1640（Life Technologies，目录号：11879020）
胎牛血清（Life Technologies，Gibco ^®）
青霉素/链霉素（Life Technologies，目录号：15140-122）
脱氧葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：D6134）
抗霉素A（Sigma-Aldrich，目录号：A8674）
RPMI 1640（Life Technologies，目录号：31800089）
谷氨酰胺（Life Technologies，目录号：25030-081）
胃酶抑素A（Sigma-Aldrich，目录号：P5318）
抑肽酶（Sigma-Aldrich，目录号：A1153）
亮肽素（Sigma-Aldrich，目录号：L2884）
苯基甲磺酰氟（PMSF）（Sigma-Aldrich，目录号：P7626）
ATP耗尽培养基（参见配方）
裂解缓冲液（见配方）
蛋白酶抑制剂混合物（见配方）
IB4 LCL的培养基（参见配方）

设备

CO <2>孵化器
离心机（Eppendorf，型号：5415D）
离心机（Eppendorf，型号：5810R）
离心机（Eppendorf，型号：5415R）
摇杆
Western印迹设备（ Bio-Rad Laboratories ）

程序

搜集 1×10 7个IBL LCL细胞，通过以1,050rpm（220×g）旋转; Eppendorf 5810R），并补加5ml ATP耗尽培养基和在CO 2培养箱（37℃）中孵育2小时
收获细胞，并用1x PBS洗涤两次
溶解细胞在0.5ml裂解缓冲液中，并将反应管置于摇动器上并在4℃下孵育1小时。收集上清液（细胞蛋白）在13,200rpm（16,100×g; Eppendorf 5415R）上，4℃下10分钟。
加入50微升ATP-琼脂糖，通过坐在摇臂下拉细胞蛋白，并在4°C孵育4小时。
搜集 ATP-琼脂糖珠通过在5,000rpm（2,300×g; Eppendorf 5415R） 1分钟，用裂解缓冲液洗涤珠子5次
向每个收集的下拉样品中加入40μl2x SDS样品缓冲液
通过蛋白质印迹分析鉴定ATP结合的蛋白质

食谱

裂解缓冲液（1 L）
1％NP-40
2mM EDTA 10％甘油
50mM Tris-HCl
150mM NaCl
蛋白酶抑制剂
1μg/ml胃酶抑素A
1μg/ml抑肽酶
1μg/ml亮肽素 0.5mM苯基甲磺酰氟 *用指定的蛋白酶抑制剂补充裂解缓冲液
ATP消耗培养基
葡萄糖（ - ）RPMI 1640补充：
10％胎牛血清
100U/ml青霉素/100μg/ml链霉素 2mM谷氨酰胺 2mM脱氧葡萄糖 300nM抗霉素A
IB4 LCL培养基
RPMI 1640补充：
10％胎牛血清
100U/ml青霉素/100μg/ml链霉素 2mM谷氨酰胺

参考文献

Liu， C.D.，Chen，Y.L.，Min，Y.L.，Zhao，B.，Cheng，C.P.，Kang， Chiu，S. J.，Kieff，E。和Peng，C.W。（2012）。核伴侣核糖体护送爱泼斯坦 - 巴尔病毒核抗原建立用于人B细胞中潜在感染的转录级联 Pathog 8（12）：e1003084。

第IV部分： < Chromatin免疫沉淀（ChIP）

材料和试剂

ATP缺乏的成淋巴细胞样细胞
IB4 LCL细胞（淋巴母细胞样细胞系）
36.5％甲醛（Sigma-Aldrich，目录号：F8775）
甘油（Sigma-Aldrich，目录号：F8775）
EDTA（Sigma-Aldrich，目录号：EDS）
染色质剪切试剂盒（活性基序）
DNA核酸酶（活性基序）
酶消化缓冲液（Active Motif）
蛋白A/G琼脂糖（EMD Millipore，目录号：IP10-10ML）
一抗（Ab1，Ab2和H3-Ac）
在这种情况下：
Ab1：EBV核抗原2特异性抗体（例如 Abcam，目录号：ab49498）
Ab2：核磷蛋白抗体（5E3）（Santa Cruz，目录号：sc-53926）
Ab3：H3-乙酰化抗体（H3-Ac）（EMD Millipore，目录号：06599）
IgG（Dako，目录号：A0424）
TE缓冲区
1M Tris-HCl
蛋白酶K（Life Technologies，目录号：25530049）
葡萄糖（ - ）RPMI 1640（Life Technologies，目录号：11879020）
RPMI 1640（Life Technologies，目录号：31800089）
胎儿小牛血清（ Life Technologies，Gibco ^{® ）}
青霉素/链霉素（Life Technologies，目录号：15140-122）
谷氨酰胺（Life Technologies，目录号：25030-081）
脱氧葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：D6134）
抗霉素A（Sigma-Aldrich，目录号：A8674）
ChIP裂解缓冲液（参见配方）
10x甘氨酸（参见配方）
ChIP稀释缓冲液（参见配方）
低盐免疫复合物洗涤缓冲液（见配方）
高盐免疫复合物洗涤缓冲液（参见配方）
LiCl免疫复合物洗涤缓冲液（参见配方）
洗脱缓冲液（见配方）
ATP消耗介质（参见配方）
IB4 LCL的培养基（参见配方）
酶溶液（见配方）
蛋白酶抑制剂（参见配方）

设备

DNA旋转柱（Geneaid Biotech）
Douncer设备（组织研磨机）（Thomas science）
离心机（Eppendorf，型号：5810R）
离心机（Eppendorf，型号：5415R）
离心机（Eppendorf，型号：5415D）
Rocker（Fisher scientific，型号：05-450-200）
1.7 ml cryptal小瓶
台式迷你离心机（Thermo Fisher Scientific）
Illumina Eco实时PCR系统

程序

取2×10 6个缺乏ATP或正常的IB4 LCL细胞，并补充10ml的ATP耗竭或常规培养基。
加 274微升36.5％甲醛至10毫升细胞做最后浓度为1％，并等待10分钟以使交联反应在室温下完成
加入1ml的10x甘氨酸至10 ml细胞淬灭未反应的甲醛，轻轻摇动在室温下孵育5分钟
颗粒细胞（400×g /孔; Eppendorf 5415D）5分钟，然后吸出上清液并用1ml冰冷的1×PBS洗涤细胞两次。最后，加入1ml 冰冷的ChIP裂解缓冲液，并在冰上放置30分钟
打破通过使用douncer匀浆器用10次冲击在冰上下降细胞将全细胞裂解物转移至1.7ml隐窝小瓶中。收集核在2,300×g下旋转5分钟。去除上清液后，重悬用260μl消化缓冲液（在37℃预热5分钟）分离核 min）。
加入12.5μl酶溶液，并在室温下酶消化15分钟
加 20μl冰冷的EDTA停止反应，沉淀消化通过在13,200rpm（16,100×g /孔; Eppendorf 5415R），4℃ 10分钟。消化的chromatins将保留在上清液中（约300μl：可应用于多达5个IP）和细胞碎片留在沉淀。请保留50微升的上清液作为染色质的输入脱氧核糖核酸。
等分50μl上清液到3个新管[3 IP： Ab1，Ab2/H3-Ac（阳性对照）和IgG]，并重新填充每个样品 950μlChIP稀释缓冲液，使1 ml体积。加入20μl蛋白 A/G琼脂糖通过坐下预清洁非特异性结合的染色质在4℃下摇动1小时。
去除预清洁剂后蛋白A/G琼脂糖，加入3μg期望的Ab1（在这种情况下为PE2），Ab2 对于H3-Aceylated（阳性对照）或IgG（阴性对照）消化的chromatins和免疫沉淀将进行将芯片样品在摇床上在4℃下放置4小时注意：最多允许5个IP。
加 30μl蛋白A/G琼脂糖到每个ChIP样品，并允许另外2小时的反应在4℃。收集蛋白A/G琼脂糖短暂使用台式迷你离心机离心
洗蛋白A/G琼脂糖与1ml冰冷的低盐免疫复合物洗涤缓冲液一次，1ml冰冷的高盐免疫复合物洗涤缓冲液一次， 1ml冰冷的LiCl免疫复合物洗涤缓冲液一次，和1ml 冰冷的TE缓冲液两次。
应用200μl洗脱缓冲液（新鲜制备）每种收集的蛋白A/G琼脂糖样品以便通过在室温下涡旋和温育来洗脱蛋白质 15分钟。 a后，每次IP反应得到200μl洗脱液短暂旋转。
向每个洗脱液中加入8μl5 M NaCl，并孵育在65℃下4小时至过夜，以逆转交联。在这步骤，样品可以储存在-20°C或继续进行下一步。
向每个样品中加入4μl0.5 M EDTA，8μl1M Tris-HCl和1μl蛋白酶K（10μg/μl），并在45°C孵育2小时。
使用旋转柱分离DNA。
通过进行实时PCR分析来定量DNA的量。 5％输入DNA将用作内部对照

食谱

ChIP裂解缓冲液
20mM Tris-HCl（pH8.0） 85 mM KCl
0.5％NP40
注意：使用前需要加入蛋白酶抑制剂。
10x甘氨酸
1.25 M甘氨酸
ChIP稀释缓冲液
0.01％SDS
1.1％Triton X-100 1.2mM EDTA
1.67mM Tris-HCl（pH8.1） 167 mM NaCl
低盐免疫复合物洗涤缓冲液
0.1％SDS
1％Triton X-100 2mM EDTA 20mM Tris-HCl（pH8.1） 150mM NaCl
高盐免疫复合物洗涤缓冲液
0.1％SDS
1％Triton X-100 2mM EDTA 20mM Tris-HCl（pH8.1） 500 mM NaCl
LiCl免疫复合物洗涤缓冲液
0.25 M LiCl
1％IGEPAL-CA630
1％脱氧胆酸（钠盐）
1mM EDTA
10mM Tris-HCl（pH8.1）
洗脱缓冲液
1％SDS
100mM NaHCO 3/v/v
ATP耗尽培养基
葡萄糖（ - ）RPMI 1640补充：
10％胎儿
小牛血清
100U/ml青霉素/100μg/ml链霉素 2mM谷氨酰胺 2mM脱氧葡萄糖 300nM抗霉素A
IB4 LCL培养基
RPMI 1640补充：
10％胎牛血清
100U/ml青霉素/100μg/ml链霉素 2mM谷氨酰胺
酶溶液
0.125μl酶储备液加上12.375μl甘油
蛋白酶抑制剂
1μg/ml胃酶抑素A
1μg/ml抑肽酶
1μg/ml亮肽素 0.5mM苯基甲磺酰氟 *用指定的蛋白酶抑制剂补充裂解缓冲液

致谢

该协议改编自Liu等人（2012）。

参考文献

Chen，Y.L.，Tsai，H.L.和Peng，C.W。（2012）。 EGCG通过降低核抗原1的DNA结合效能使衰弱EBV潜伏期的持续性。 Biochem Bi ophys Res Commun 417（3）：1093-1099。
Liu， C.D.，Chen，Y.L.，Min，Y.L.，Zhao，B.，Cheng，C.P.，Kang， Chiu，S. J.，Kieff，E。和Peng，C.W。（2012）。核伴侣核糖体护送爱泼斯坦 - 巴尔病毒核抗原建立用于人B细胞中潜在感染的转录级联 Pathog 8（12）：e1003084。