材料和试剂

新鲜抗凝血液（约10ml）
没有Ca 2+和Mg 2+的PBS（Nacalai tesque，目录号：14249-95）的
Ficoll-paque Plus（GE Healthcare，目录号：17-1440-02）
StemSpan H3000（STEMCELL Technologies，目录号：09800）
重组人白细胞介素（IL）-6（100μg/ml）（PeproTech，目录号：AF-200-06）
重组人干细胞因子（SCF）（300μg/ml）（PeproTech，目录号：AF-300-07）
重组人血小板生成素（TPO）（300μg/ml）（PeproTech，目录号：AF-300-18）
重组人Flt3配体（300μg/ml）（PeproTech，目录号：AF-300-19）
重组人白细胞介素（IL）-3（10μg/ml）（PeproTech，目录号：AF-200-03）
重组人碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）（10μg/ml）（Wako，目录号：064-04541）
Amaxa人CD34 +细胞Nucleofector Kit（Lonza，目录号：VPA-1003）
MEF进料器（Repro Cell，目录号：RCHEFC003）
减少Matrigel生长因子（BD Biosciences，目录号：356231）
Primate ES细胞培养基（Repro Cell，目录号：RCHEMD001）
Essential 6（Life Technologies，目录号：A1516401）
明胶（Sigma-Aldrich，目录号：G1890）
Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）具有稳定的L-谷氨酰胺的高葡萄糖（Nacalai tesque，目录号：08459-35）
胎牛血清（FBS）（Life Technologies，目录号：10437-028）
质粒组2（Life Technologies，目录号：A15960）
血液介质（见配方）
质粒混合物（参见配方）
转染混合物（参见配方）
iPS介质1（参见配方）
iPS介质2（参见配方）
0.1％明胶溶液（见配方）
MEF介质（参见配方）

设备

核转染体2b（Lonza，目录号：AAB-1001）

6孔组织培养板（ BD Biosciences，Falcon ，程序

第0天

培养基制备：
1. 向6孔板的孔中加入2ml含有细胞因子的血液培养基。
2. 在板的剩余孔中加入2ml PBS以防止培养基的过度蒸发，并将板在37℃，5％CO 2下保存。
单核细胞的纯化：
1. 向10ml抗凝血（EDTA）中加入10ml PBS
2. 在两个15毫升管中，加入5毫升Ficoll-Paque，轻轻加入10毫升血液+ PBS
3. 在40℃下旋转管在18℃下30分钟。使用慢加速和慢刹车。
4. 去除血浆（约2毫升）的顶部部分，而不破坏界面上的单核细胞
5. 将细胞在界面（1-2毫升）转移到15毫升管，与12毫升PBS充分混合
6. 在18℃下以200转/分钟的速度旋转10分钟（慢速制动）
7. 重悬细胞在3毫升H3000培养基和计数细胞
8. 在1.5ml管中制备3×10 6个细胞的等分试样
9. 在18℃下以200×g离心10分钟（慢速制动）。
10. 吸出上清液。
电镀：
1. 将细胞重悬在步骤1中制备的培养基中。
2. 将板在37℃，5％CO 2储存约6天。在此培养期间不需要中等变化。

第5天

明胶包衣：
1. 将1ml /孔的0.1％明胶溶液加入6孔板中
2. 在37℃下孵育平板至少半小时。
MEF饲养细胞的制备：
1. 解冻MEF饲养细胞在37°C，并计数细胞数量
2. 吸出上面制备的过量明胶溶液
3. 将MEF饲养细胞以3×10 5个细胞/孔接种在MEF培养基中

第6天

培养基制备：
1. 从MEF饲养细胞吸出培养基。
2. 加入2毫升/孔含有细胞因子的血液培养基
收获培养的细胞：
1. 重悬细胞在培养基中并计数细胞。活细胞数通常约为1×10 ⁶。
2. 收获浮动细胞到15毫升管
3. 在18℃下以200×g离心10分钟（慢速制动）。在旋转期间，准备转染混合物
核转染：
1. 用移液管用手完全吸出细胞的上清液。
2. 加入转染混合物并悬浮细胞，小心不要产生任何气泡。
3. 使用程序U-008进行核转染
电镀，每孔10 10至10 10个细胞：
1. 在核转染后立即，向电穿孔比色杯中加入800μlH3000，并收获细胞。核转染溶液中的金属离子对细胞有毒！
2. 将细胞以每孔5×10 5个细胞至5×10 4个细胞平板接种到MEF饲养板上。

第8,10和12天

每孔加入另外的1.5ml iPS培养基1。不要吸入现有介质。

第14天 -

用每孔1.5ml iPS培养基1更换培养基。
*每2天进行一次中等更换。

第25至35天

挑选约2mm直径的菌落。

笔记

冷冻的外周血单核细胞（PBMC）可以与该方案一起使用。在第0天将解冻的PBMC直接培养在血液培养基中。
iPSCs可以在非饲养条件下建立，但效率低。对于非进料条件，使用Matrigel包被板和iPS培养基2代替MEF进料器和iPS培养基1.以下是制备Matrigel包被板的程序。
1. 解冻Matrigel在4°C，稀释它相当于2毫克的蛋白质在6毫升冷却的DMEM。
2. 将1ml /孔的溶液加入6孔板中
3. 在室温储存1小时。
4. 在细胞接种前用PBS洗涤板一次。

食谱

血液介质
StemSpan H3000，含有以下细胞因子：
10 ng/ml IL-3
100ng/ml IL-6
300 ng/ml SCF
300 ng/ml TPO
300ng/ml Flt3配体准备后立即使用

质粒混合物（Addgene， http://www.addgene.org/Shinya_Yamanaka ）
使用以下质粒混合物。组1显示更高的效率。在集合2中，我们省略了WPRE序列并且取代针对p53的shRNA与显示阴性形式的小鼠p53，其存在于组1中。存储在-20℃。组2可以购买来自Life Technologies。

质粒组1	pCXLE-hOCT3/4-shp53-F	0.83克
	pCXLE-hSK	0.83克
	pCXLE-hUL	0.83克
	pCXWB-EBNA1	0.5克
质粒组2	pCE-hOCT3/4	0.63克
	pCE-hSK	0.63克
	pCE-hUL	0.63克
	pCE-mp53DD	0.63克
	pCXB-EBNA1	0.5克

转染混合物

Amaxa CD34解决方案
81.8微升

补充
18.2μl

质粒混合物（组1或2）
3μl（3μg）

准备后立即使用
iPS介质1
含有4ng/ml bFGF的灵长类ES细胞培养基在4℃下储存1周，在暗处
iPS中等2
含有100ng/ml bFGF的Essential 6 在4℃下储存1周，在暗处
0.1％（w/v）明胶溶液
1. 将1g明胶粉末溶解在100ml dH 2 O（1％w/v，10x浓度）中，高压灭菌并在4℃下储存。
2. 为了制备0.1％（1x）明胶溶液，在37℃下加热10x明胶储备液，将其加入到450ml dH 2 O中。用瓶顶过滤器（0.22μm）过滤溶液，并在4℃下保存
MEF培养基
含有10％FBS的DMEM

致谢

我们感谢T. Aoi，K. Takahashi，M. Nakagawa和Y. Yoshida的科学讨论; M. Narita，T. Ichisaka和M.Ohuchi的技术援助; R. Kato，E. Nishikawa，S.Takeshima，and Y.Ohtsu for administrative assistance;和Drs。 H.Niwa（RIKEN）和J. Miyazaki（大阪大学）的CAG启动子。这项研究得到了国家生物医学创新研究所健康科学基础研究计划资助，教育，文化，体育，科学和技术部领导项目（MEXT）的资助，日本社会科学促进科学技术世界领先创新研究与发展（FIRST计划）资助计划，日本科学促进科学研究计划资助计划），以及青年科学家B（KO）科学研究助学金。

参考文献

Mack，A.A.，Kroboth，S.，Rajesh，D。和Wang，W.B。（2011）。从具有非整合游离载体的多个供体获得的血液中从CD34 +细胞产生诱导多能干细胞。 PLoS One 6（11）：e27956。
Okita，A.，Morizane，A.，Okamoto，S.，Hong，H.，Nakagawa，M.，Tanabe，K.，Tezuka，K。， Shibata，T.，Kunisada，T.，Takahashi，M.，Takahashi，J.，Saji，H.and Yamanaka，S。（2011）。一种更有效的方法来生成无集成的人类iPS细胞。 Nat Methods 8（5）：409-412。
Okita，K.，Yamakawa，T.，Matsumura，Y.，Sato，Y.，Amano，N.，Watanabe，A.，Goshima，N.and Yamanaka，一种有效的非病毒方法，用于从脐带血和外周血中产生无整合的人诱导多能干细胞细胞。干细胞 31（3）：458-466。