材料和试剂

QIAquick PCR纯化试剂盒（QIAGEN，目录号：28104）
QIAquick凝胶提取试剂盒（QIAGEN，目录号：28704）
MinElute PCR纯化试剂盒（QIAGEN，目录号：28004），将柱子保存在4℃。
Gibco UltraPure水（Life Technologies，Gibco ，目录号：10977-015）
末端DNA末端修复试剂盒（Epicentre ，目录号：ER0720）
Klenow片段（3'≥5'外切）（New England Biolabs，目录号：M0212S）
100mM dATP（Life Technologies，Invitrogen TM，目录号：10216-018或VWR International，目录号：PAU1201）
LigaFast连接试剂盒（Promega corporation，目录号：M8221）
乙醇
洗脱缓冲液
结束修复缓冲区
Klenow缓冲区
青色/橙色装载缓冲区
2％E-gel，预制琼脂糖凝胶（Life Technologies，Invitrogen TM）（可以用自制的2％琼脂糖凝胶代替）
Phusion HF PCR主混合物（New England Biolabs，目录号：F531S或F531L）
来自Illumina测序试剂盒的Illumina Adaptor寡核苷酸混合物，但是可以使用如参考文献1中所述的快速变性和缓慢再退火的自制寡核苷酸混合物替换。接头寡核苷酸序列是：
5'P-GATCGGAAGAGCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG
5'ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
来自Illumina测序试剂盒的Illumina PCR引物1.1和2.1，但可以用具有以下序列的普通合成寡核苷酸代替：
Illum1.1：
5'AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCC
GATCT
Illum2.1：
5'CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCT

设备

BECKMAN离心机和转子（Beckman Coulter）
PCR热循环仪（PerkinElmer或F.Hoffmann-La Roche）
NanoDrop微量紫外可见分光光度计

程序

从乙醇沉淀的ChIP DNA纯化。使用QIAquick PCR纯化试剂盒，并在50μl洗脱缓冲液中洗脱。使用34μl用于文库构建，其余用于qPCR验证
输入DNA需要在制作文库之前稀释。纯化后，通过Nanodrop测量输入DNA的浓度。如果读数为20 ng /μl，稀释5倍，如果接近40 ng /μl稀释10倍。
端修：
将以下组分在1.5 ml Eppendorf管中混合：
34μl纯化的ChIP DNA（或加入最多34μl的Gibco水）
5μl10x末端修复缓冲液
5μl2.5mM dNTP混合物
5μl10 mM ATP
1μl末端修复酶混合物
总共50μl
在室温（RT）下孵育45分钟使用QIAquick PCR纯化柱纯化，在34μl中洗脱
在3'末端加上'A'碱基：
将以下组分在1.5ml Eppendorf管中混合：
34μl来自步骤3的ChIP DNA
5μlKlenow缓冲液= NEB缓冲液2
10μl1 mM dATP
1μlKlenow片段（3'-5'外切负）
50μl总反应体积
（1mM dATP从100mM dATP储液稀释并等分为25μl，仅冻融一次）
在37℃孵育30分钟。
使用MinElute PCR纯化柱纯化，在12μl中洗脱
适配器连接：
将以下组分在1.5 ml Eppendorf管中混合：
11μl来自步骤4的ChIP DNA
15μlDNA连接酶缓冲液
1μl1:20稀释的接头寡聚体
3μlDNA连接酶
总共30μl
（如果进行多路复用，请确保在每个反应中添加不同的适配器，并清楚标记。）
在室温下孵育15分钟。
凝胶选择，以摆脱过多的适配器：
将青色/橙色加载缓冲液稀释10倍，向来自步骤5的30μl反应物中加入6μl，加载到E-gel的两个孔中。也加载20μl10倍稀释的50 bp梯。运行E凝胶20分钟。
在150和450 bp之间切割。使用QIAquick凝胶提取试剂盒纯化DNA，在30μl缓冲液中洗脱
用Illumina引物进行PCR：
用Gibco水稀释1：1稀释的Illumina PCR引物1.1和2.1。
在PCR条管中混合以下组分：
30μl来自步骤4的ChIP DNA
28μlPhusion PCR mastermix
1μl稀释引物1.1
1μl稀释引物2.1
总反应体积为60微升
运行PCR循环：
98°C 30秒
98℃10秒
65°C 30秒
72°C 30秒
GOTO步骤2 15次
72℃5分钟
4°C保持
在2％琼脂糖凝胶上的大小选择：
加入1微升未稀释的青色/橙色加载染料到PCR反应，加载所有在3孔在E-gel，运行30分钟与20微升1:10稀释50 bp梯和20微升1:10稀释100 bp梯。
在150和450 bp之间切割。在切片切除前后拍照。确保避免〜100 bp适配器带。一个好的图书馆应该有一个以〜200 bp为中心的涂片。在〜100bp的强谱带表示适配器的过扩增，并且文库可能不够好质量使用QIAquick凝胶提取试剂盒纯化DNA，并在30μl缓冲液中洗脱
测量DNA浓度：
使用NanoDrop测量DNA浓度。好的文库应该相对集中（例如，<10ng /μl）。

致谢

该协议已经由斯坦福大学的Snyder实验室中的不同研究者测试和优化（Lefrancois等人，2009）。

参考文献

Lefrancois，P.，Euskirchen，G.M.，Auerbach，R.K.，Rozowsky，J.，Gibson，T.，Yellman，C.M.，Gerstein，M.and Snyder，M.（2009）。使用多重短读DNA测序的高效酵母ChIP-Seq。 BMC Genomics 10：37.
Lefrancois，P.，Zheng，W。和Snyder，M。（2010）。 ChIP-Seq使用高通量DNA测序在转录因子结合位点的全基因组鉴定。/a> Methods Enzymol 470：77-104。