材料和试剂

转化的巴斯德毕赤酵母细胞（Invitrogen，目录号：V200-20）
聚-L-赖氨酸溶液（0.1％w/v水溶液）（Sigma-Aldrich，目录号：P4707）
聚乙二醇6000（PEG6000）（Merck KGaA，目录号：807491）
甘油（Sinopharm Chemical Reagent，目录号：10010692）
酵母提取物（Oxoid，目录号：LP0021）
蛋白胨（Oxoid，目录号：LP0037）
D-葡萄糖（Sinopharm Chemical Reagent，目录号：10010592）
MES
标准介质缓冲液（pH 6.0）（参见配方）
酵母提取物蛋白胨葡萄糖（YPD）培养基（参见配方）
校准介质缓冲液（pH 7.0）（参见配方）
校准介质缓冲液（pH 5.0）（参见配方）

设备

非侵入式微测试系统（YoungerUSA，型号：NMT100系列）
摇床培养箱（上海安亭科学仪器厂，型号：HZQ-F160）
离心机（Thermo Fisher Scientific，型号：Fresco 21）
微孔板读数器光谱（Molecular Devices，型号：SpectraMax 190）
玻璃盖片（20mm×20mm）
培养皿（直径35mm）
微量移液器（Eppendorf，100-1,000μl和10-100μl）

软件

JCal V3.2.1（免费的MS Excel电子表格，可在 http://www.youngerusa.com 或< a target ="_ blank"href ="http://www.ifluxes.com/"> http://www.ifluxes.com ）
ASET 2.0软件（位于 http://www.youngerusa.com ）
iFluxes 1.0软件（可从 http://www.youngerusa.com 获得）

程序

将转化的细胞在10ml YPD中在30℃下在振荡培养箱（200rpm）中孵育12小时。
将不同转化细胞的过夜培养物调整至0.2的OD 600nm。使用酶标仪光谱监测OD <600nm
各取50微升并加入到10ml终浓度为25％PEG6000或1M甘油或无外源性渗压剂的YPD中。转化的酵母细胞在30℃下在振荡培养箱（200rpm）中在含有不同外源性渗压剂的YPD中生长至OD 600nm为1.0。使用酶标仪光谱监测OD <600nm
取每份1毫升，在室温下以2,000rpm离心5分钟
除去9百微升的上清液，将细胞重悬浮于剩余的YPD培养基中。
将盖玻片浸没在聚-L-赖氨酸溶液（0.1％w/v水溶液）中24小时。
在每次通量测量之前，必须根据相同的程序和标准，分别在校准介质（pH 7.0和pH 5.0）中校准微电极。只有具有能斯脱斜率的Ca 2+电极。 26mV/decade和Hernon +电极，其Nernstian斜率>协议中使用53 mV/decade。如果后测试校准失败，则会丢弃数据。
将10微升转化细胞加载到盖玻片上5分钟，用标准培养基洗涤以确保附着细胞的单层，并在室温下在标准培养基中温育5分钟。
微电极位于由具有相等大小的15个细胞组成的附着细胞群上方10μm。在两个偏移点处测量微伏电压差，在细胞群体上方一个10μm 其它20μm，以0.05Hz的频率通过计算机操作。监测每个细胞群附近的净Ca 2+和^{+通量的动力学10分钟。}
对于每个样品，将四个克隆在10ml YPD中孵育，并测量所得的四个细胞群体（参见步骤1-9）。
微电压差在通过使用JCal V3.2.1转换成净Ca 2+和μH +通量之前被导出为原始数据。围绕每种类型的转化细胞的离子流测定独立地复制三次

图1.离子通量检测示意图（ www.xuyue.net ）。微电极尖端填充有液体离子交换剂（LIX）。通过静电计在行程范围dx 上的两个位置之间测量电压梯度（ dV 。基于dV计算浓度梯度（ dc ）。，离子扩散常数; J ，净离子流量。

食谱

标准介质（水溶液）缓冲液（pH 6.0）
0.1mM CaCl 2/v/v 0.1 mM KCl
0.3 mM MES
10mM葡萄糖用盐酸将pH调节至6.0 储存在4°C
酵母提取物蛋白胨葡萄糖（YPD）培养基（1L）
1％酵母提取物
2％蛋白胨
2％D-葡萄糖（高压灭菌后加入培养基） 10g酵母提取物
将20g蛋白胨溶解在900ml水中
培养基在液体循环中高压灭菌20分钟，冷却至〜55℃ 与100ml 20％D-葡萄糖混合液体介质在室温下贮存
校准介质（水溶液）缓冲液（pH 7.0）
0.01mM CaCl 2·h/v 0.1 mM KCl
0.3 mM MES
10mM葡萄糖用盐酸将pH调节至7.0 培养基在4℃下保存
校准介质（水溶液）缓冲液（pH 5.0）
0.1mM CaCl 2/v/v 0.1 mM KCl
0.3 mM MES
10mM葡萄糖用盐酸将pH调节至5.0 培养基在4℃下保存

致谢

该协议改编自我们先前发表的论文Li （2013）。我们要感谢美国（北京徐越）NMT服务中心的技术支持。这项研究得到了中国科学院知识创新计划（项目编号KZCX2-YW-BR-17）和中国国家自然科学基金（41371264,41401281）的资助。

参考文献

Li，T.，Hu，Y.J.，Hao，Z.P.，Li，H.，Wang，Y.S.and Chen，B.D。（2013）。首次克隆和表征来自丛枝菌根真菌的两种功能性水通道蛋白基因Glomus intraradices 。 New Phytol 197（2）：617-630。
McLamore，E. S.和Porterfield，D.M。（2011）。用于测量代谢和生物物理分析物转运的非侵入性工具：自参考生理感测。 Chem Soc Rev 40（11）：5308-5320。
Shabala，L.，Ross，T.，McMeekin，T。和Shabala，S。（2006）。用于研究微生物对环境的适应性反应的非侵入性微电极离子通量测量。 FEMS Microbiol Rev 30（3）：472-486。
Shabala，L.，Ross，T.，Newman，I.，McMeekin，T。和Shabala，S。（2001）。净通量和H ⁺，Ca
Wang，Q.，Zhao，Y.，Luo，W.，Li，R.，He，Q.，Fang，X.，Michele，RD，Ast，C.，von Wiren，N.and Lin， 2013）。单粒子分析揭示了拟南芥铵转运蛋白AMT1的截止控制; 3通过聚类和内化。 Proc Natl Acad Sci U S A 110（32）：13204-13209。
Xu，R.R.，Qi，S.D.，Lu，L.T.，Chen，C.T.，Wu，C.A。和Zheng，C.C。 DExD/H盒RNA解旋酶对于拟南芥中的K +剥夺反应和耐受性很重要。 FEBS J 278（13）：2296-2306。