材料和试剂

要分析的单元格
低熔点（LMP）琼脂糖（Sigma-Aldrich，目录号：A9414）
Seakem 琼脂糖（Ozyme，目录号：LON50004）
PBS（Ca 2+和Mg 2+ +无磷酸盐缓冲盐水）中的至少一种。
5 N NaOH
0.5 M EDTA二钠盐溶液（pH 8）
Trisma碱基
Triton X-100
N-月桂酰肌氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：L5125）
二甲基亚砜（DMSO）
绝对乙醇
溴化乙锭（10mg/ml）
胰蛋白酶/EDTA
醋酸钠
裂解溶液（参见配方）
电泳溶液（参见配方）

设备

显微镜超级霜和玻璃滑块
Malassez房间
显微镜盖玻片（22×22mm）
显微镜盖玻片（24×32mm）
离心机
电泳槽：经济潜水艇（20cm x 30cm）（美国科学科学院）
荧光显微镜，照相机和软件（例如配备有Luca S照相机和Komet 6.0软件的Nikon Eclipse 50i显微镜）

软件

Komet 6.0软件（安卓技术）

程序

准备琼脂糖溶液和幻灯片。
1. 实验前至少24小时：
  1. 制备0.8％的Seakem 琼脂在PBS中的溶液
  2. 通过浸渍在含有熔化的琼脂糖的垂直罐中预涂覆超级霜冻载玻片，用磁力搅拌器搅拌并保持在100℃（图1）。
    
    图1.用琼脂糖涂布载玻片
  3. 通过擦拭载玻片的背面，过量地除去琼脂糖（图2）。
    
    图2.涂有琼脂糖的玻片。取出载玻片背面的琼脂糖。
  4. 让载玻片干燥，然后在室温下储存，直到使用。
2. 在实验前至少2小时：制备0.7％的LMP琼脂糖的PBS溶液，并将其置于37℃水浴中直至使用。
准备单元格
可以根据细胞的大小调整收获的细胞的数量。可以通过自动细胞计数器或计数室（例如Malassez室）对细胞进行编号。
如果使用的细胞是粘附的，细胞必须小心地用胰蛋白酶/EDTA分离，并在离心和进一步使用之前分离
将细胞嵌入LMP琼脂糖（在暗室中）：
1. 细胞离心后，弃去上清液，用200μl的0.7％LMP琼脂糖轻轻吹打重悬细胞沉淀（150,000至200,000个细胞）。
2. 将65微升含有细胞的琼脂糖置于每个预涂玻片上
3. 立即盖上一个24 x 32毫米的盖玻片。
4. 将载玻片放在冰袋上固化5-10分钟。
5. 滑动盖玻片以将其移除。
6. 最后盖上80微升的LMP琼脂糖（顶层琼脂糖层），再盖上一个24×32毫米的盖玻片。
7. 将载玻片再次放在冰袋上固化5-10分钟。
8. 取出盖玻片。
裂解和电泳（在暗室中）：
1. 将载玻片放在裂解液中至少1小时，在4℃
2. 用电泳缓冲液洗涤三次，每次5分钟。
3. 在装有电泳溶液的电泳槽中转移载玻片（图3）
  
  图3.载玻片的电泳。在槽中处理载玻片。在这种情况下，8个载玻片进行电泳，每行4个
4. 在18 V（0.5 V/cm）下进行电泳1小时。
5. 在PBS中洗2次，每次5分钟。
脱水，染色和分析：
1. 固定细胞在无水乙醇中2×10分钟洗涤，在室温下风干至少2小时
2. 在显微镜载玻片上加入50微升溴化乙锭（2微克/毫升，在水中），盖上一个22 x 22毫米的盖玻片进行染色。
3. 分析细胞：每张幻灯片评分50个细胞，每个条件2个载玻片，配备有照相机和适配软件的荧光显微镜（图4和5）。
  
  图4.表示每个单元格的分析
  
  a =头长
  b =尾长
  ％尾DNA =尾巴中DNA的比例
  尾矩=％尾DNA×b
  彗尾长度可以通过不同的方法计算，取决于作者。尾矩是用于表征彗星的常用参数。为此，通过尾部中的荧光评估尾部中的DNA分数，并除以以百分比表示的总荧光（在头部和尾部中）。尾矩是％尾DNA和尾长的乘积
  
  图5.表示未受损细胞核的图像，对于存在彗星（左图）和呈现彗星的受损细胞的细胞核（右图）为阴性的图像
  
  作为阳性对照，在20Gy下用电离辐射照射并在照射后立即检查的细胞是如上述照片中所示的良好对照。

食谱

裂解液
2.5 M NaCl
0.1 M EDTA
10mM Trizma碱（pH 10）
1％N-月桂基肌氨酸 0.5％Triton X-100 10％DMSO最终
保持在4°C
电泳溶液
300mM乙酸钠 100mM Tris-HCl（pH8.3），4℃

致谢

该方案改编自以前发表的论文（Courilleau等人，2012; Olive等人，1990; Ostling和Johanson，1984; Ostling和Johanson，1987） ; Wojewodzka等人，2002）。

参考文献

Courilleau，C.，Chailleux，C.，Jauneau，A.，Grimal，F.，Briois，S.，Boutet-Robinet，E.，Boudsocq，F.，Trouche，D。和Canitrot，染色质重塑p400 ATP酶促进Rad51介导的DNA双链断裂修复。 J Cell Biol 199（7）：1067-1081。
Olive，D.M.，Johny，M。和Sethi，S.K。（1990）。使用碱性磷酸酶标记的合成寡核苷酸探针检测空肠弯曲杆菌 >和弯曲杆菌。 J Clin Microbiol 28（7）：1565-1569。
Ostling，O。和Johanson，K.J。（1984）。辐射诱导的DNA损伤在个体哺乳动物细胞中的微电泳研究生化Biophys Res Commun 123（1）：291-298
Ostling，O。和Johanson，K.J。（1987）。与γ-照射相反，博来霉素诱导DNA链从细胞到细胞的破坏的极端变异。/a> Int J Radiat Biol Relat Stud Phys Chem Med 52（5）：683-691。
Wojewodzka，M.，Buraczewska，I。和Kruszewski，M。（2002）。经过修改的中性彗星测定：消除高温下的裂解并验证抗单克隆抗体-stranded DNA antibody。 518（1）：9-20。