[Principle] 中断的植物组织释放可溶性AGP，可以沉淀为其Yariv复合物。该程序主要产生经典AGP; 这些包括大量的细胞表面AGP。用CaCl 2提取而不是更常用的NaCl具有两个优点：

其导致由葡萄糖醛酸残基紧密结合的Ca 2+ 2+（Lamport和Varnai，2013），在> pH 4.5，从而在其从不溶性Yariv复合物释放后增强AGP溶解度
它将果胶作为通过分子间Ca 2+ 2+桥键交联的不溶性钙果胶，而具有分子内Ca 2+ 2 +的AGP保持溶解。

材料和试剂

烟草BY-2细胞或其他植物组织
液氮
CaCl 2（2％w/v）
蒸馏水
焦亚硫酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：S-1256）
透析管12kDa MW截留（3.2cm平宽）（Sigma-Aldrich，目录号：D-0530）
Superose-6,10/300GL（GE Healthcare，目录号：17-5172-01）
羟脯氨酸
葡萄糖醛酸
阿拉伯胶（Sigma-Aldrich，目录号：G-9752）
NaCl
NaOH
Yariv试剂（Biosupplies Australia Pty，目录号：100-2）（参见Recipes）

设备

搅拌机/咖啡磨机
Minifuge离心机
2 ml Sarstedt管（带螺旋盖）
分光光度计或酶标仪
质谱仪
Microfuge
精细移液器
细尖音波探头
阻止加热器

程序

在液氮中冷冻〜10至100g植物组织
在冷混合器/咖啡磨中将冷冻的新鲜组织粉碎成细粉
在室温下将组织在2％w/v CaCl 2中搅拌2-3小时（每克组织2ml）。
以〜10,000英寸×g （例如例如离心机在RT）离心30分钟。
测定10,50和100μl等分试样以估计提取物中的总AGP（参见注释）
在剩余的提取物中加入稍微过量的Yariv试剂（见注释）。
在室温下至少沉淀1小时或过夜。
通过低速离心（在2,000×g下10分钟）收集沉淀物
在1.5ml蒸馏水中重悬沉淀
转移到2ml Sarstedt管（带螺旋盖）
加入〜25mg焦亚硫酸钠（最终浓度为70mM）以减少重氮连接（补充H 2 O以排出氧，否则会导致形成元素硫）。
盖管密封并在〜50℃加热直至脱色（5-20分钟）
转移至小（〜5ml）透析袋; 在室温下在500ml蒸馏H 2 O中搅拌过夜，并更换H 2 O三次。
在液氮中冷冻透析液，冻干，然后称重产品。（AGP产量从30-300μgAGP/g鲜重取决于组织来源）（见注释）
通过大小和组成验证经典AGP：
1. 在Superose-6上凝胶过滤（Lamport，et al。，2006）。
2. 羟脯氨酸含量（Kivirikko和Liesmaa，1959）
3. 糖酸含量（Blumenkrantz和Asboe-Hansen，1973）
4. 通过色度法结合钙（Gindler和King，1972）或ICPMS（电感耦合等离子体质谱）（Lamport和Varnai，2013）。
5. 氨基酸和糖分析。

笔记

通过Yariv试剂进行的阿拉伯半乳聚糖蛋白测定。
所有步骤在RT。
1. 将试样加入Eppendorf微量离心管中
2. 补充至〜500μl在1％CaCl 2中。
3. 使用10和20μg阿拉伯胶作为AGP"标准品"，如下：
  将10μl阿拉伯胶（1mg/ml）加入到500μl1％CaCl 2中。
  将20μl阿拉伯树胶（1mg/ml）加入500μl1％CaCl 2
4. 使用500μl1％CaCl 2 2作为试剂空白。
5. 然后对每个管：
  加入200μlβ-D-半乳糖基 - Yariv试剂（1mg/ml，在2％CaCl 2中）
  或使用β-D-葡萄糖基 - Yariv试剂 - 根据可用性选择
6. 混合均匀，在室温下放置至少30分钟
7. 在微型离心机中以约15,000英尺/分钟的速度旋转10分钟。
8. 用CARE使用细尖移液管去除& 丢弃上清液
9. 用1ml 2％CaCl 2洗涤沉淀两次。
10. 加入1ml 20mM NaOH
11. 剧烈摇动以溶解沉淀或用细探针或在声波浴中声处理10-20秒。如果溶液是混浊的，在〜15,000×g下旋转以澄清
12. 在一小时左右内，相对于试剂空白读取A 457 nm。当从完整BY-2细胞中洗脱Yariv时，a <457 避免酚类干扰; 用于在440nm读取的一般测定。
13. 绘制"标准曲线"并计算未知数，如μgAGP /管注意：阿拉伯胶定量仅是近似值，因为每个AGP结合不同量的Yariv。
  然而，作为一般指导，给定重量的Yariv试剂将沉淀相同重量的AGP。因此，对于AGP分离，10％过量的Yariv试剂通常足以沉淀所有AGP
AGP细胞分布（背景信息）：
经典AGP是分布在三个细胞表面区室中的必需糖蛋白：通过GPI锚与细胞膜的外表面结合; 可溶于周质; 并"结合"或捕获在壁基质中。
因此AGP细胞分布T = M + S + W（Lamport等人，2006）
M =与质膜结合的AGP S =细胞破坏所释放的可溶性AGP
W =与细胞壁结合的AGP

表1.烟草BY-2细胞中AGP的总量。在烟草BY-2细胞中，T = 600μgAGPs g鲜重

BY-2单元格

（ 6 中的数据）

T总计
M膜结合
S可溶性周质

W有界限

盐适应*
600
60
354
186

控制
600
210
282
108

*由高盐上调的AGP出现在生长培养基中

食谱

Yariv试剂（1,3,5-三 - （对-β-D-半乳糖基氧基苯基偶氮）-2,4,6-三羟基苯）或β-D-葡糖基衍生物的制备
将100mgβ-D-半乳糖基Yariv溶解在100ml 2％w/v CaCl 2中

致谢

该协议改编自Popper（2011），Lamport和Varnai（2013）和Lamport等人（2006）。

参考文献

Blumenkrantz，N。和Asboe-Hansen，G。（1973）。定量测定糖醛酸的新方法 Anal Biochem 54（2）：484-489。
Darjania，L.，Ichise，N.，Ichikawa，S.，Okamoto，T.，Okuyama，H。和Thompson Jr，G.A。（2002）。在培养的拟南芥细胞中动态更新阿拉伯半乳聚糖蛋白。 Plant Physiol Biochem 40（1）：69-79
Gindler，E。和King，J。（1972）。用甲基百里酚蓝快速比色测定生物液中的钙。美国Clin Pathol 58（4）：376-82。
Kivirikko，K.I.和Liesmaa，M.A。（1959）。用于测定组织水解产物中羟脯氨酸的比色法。斯堪的纳维亚J Clin Lab 11（2）：128-133
Lamport，D.T.和Varnai，P.（2013）。周质阿拉伯半乳聚糖糖蛋白作为钙电容器调节植物生长， New Phytol 197（1）：58-64。
Lamport，D.T.，Kieliszewski，M.J.and Showalter，A.M。（2006）。盐胁迫上调周质阿拉伯半乳聚糖蛋白：使用盐胁迫分析AGP功能。 New Phytol 169（3）：479-492。
Popper，Z.A。（2011）。提取和检测植物细胞壁中的阿拉伯半乳聚糖蛋白 - 方法和方案，由John M. Walker编辑。 Humana Press ，纽约，第245-254页。
Qi，W.，Fong，C。和Lamport，D.T。（1991）。阿拉伯胶糖蛋白是一种扭曲的毛状绳：基于o-半乳糖基羟基脯氨酸作为多糖附着的新模型site。 Plant Physiol 96（3）：848-855。
Zhao，Z.D.，Tan，L.，Showalter，A.M.，Lamport，D.T.and Kieliszewski，M.J。（2002）。从转基因烟草中纯化的番茄LeAGP-1阿拉伯半乳聚糖蛋白证实了Hyp毗连假说。 Plant J 31（4）：431-444。