材料和试剂

拟南芥（拟南芥）的叶子
乙磺酸（Mes）-KOH
MES/KCl缓冲液，pH6.15（参见配方）

设备

光学显微镜
目镜千分尺和平台千分尺
玻璃滑盖和盖玻璃
直径6cm的培养皿
眼眉刷（黄狼毛，头发长度：0.8cm，头发宽度：0.8cm）
镊子

程序

抽样
将拟南芥幼苗在16小时光照/8小时黑暗循环下在植物生长室中长成，光子通量密度为0.1mmol / m ²/s，昼/夜温度周期为18°C/22°C 4-6周。收获最年轻，完全展开和扁平的叶子以供立即使用注意：
1. 为了避免对气孔孔径的任何潜在节律效应，取样总是在一天的同一时间开始，并在中午避免。
2. 对于所有处理，始终对处于相同发育阶段的叶子进行取样。
3. 对于每次处理，至少收获三片来自不同植物并处于相同发育阶段的叶子。
打开气孔
对于气孔关闭实验，为了在开始处理之前确保气孔处于完全打开的阶段，首先将新鲜取样的平叶漂浮，其背面朝上在6cm直径培养皿中的MES/KCl缓冲液（15ml）在光照条件（0.1mmol/m 2/s）下在22℃温育3小时以打开气孔，然后用于随后的处理。
处理样品
一旦气孔完全打开（如下面的程序通过显微镜检查），然后将叶子在上述相同的白光条件下在22℃漂浮在单独的MES/KCl缓冲液或含有各种化合物或抑制剂所需的时间，或在所需条件下。控制处理涉及添加缓冲液或与抑制剂一起使用的适当溶剂注意：
1. 对于每次处理，处理来自不同植物的至少三片叶。
2. 因为表皮条比拟南芥叶的近轴表面更容易从后轴表面剥离，所以我们仅从叶的背轴表面剥离表皮条，用于随后测量气孔孔径。因此，对于UV-B辐射以及其它光的处理，为了确保接受相同剂量的UV-B辐射的叶子的背面表面以及其它光，叶子浮动，它们的背面朝上并垂直于所有处理中的光照在MES/KCl缓冲液上，包括打开气孔。
剥皮表皮条和制作载玻片
在上述处理之后，从MES/KCl缓冲液中取出叶子，并使用一片滤纸吸收叶子表面上的MES/KCl缓冲液。将叶片平放在载玻片上，其背面朝上，用镊子夹住叶尖附近的背轴表皮和叶肉细胞的一部分，并且将表皮条带随主叶的方向快速剥离静脉。然后，将剥离的表皮条立即浸入相应的处理缓冲液中，并通过镊子推到培养皿的底部，通过眉毛刷轻轻地从表皮条上除去剩余的叶肉细胞（图1），并且将表皮尖切下带有更多叶肉细胞的镊子夹住的条，然后用相应的处理缓冲液制成载玻片。

图1.眉笔
用光学显微镜测量气孔孔径
在您使用的光学显微镜中安装目镜测微计和台式千分尺，校准微米刻度，并且在每个重复中在校准的显微镜下对五十至九十个随机选择的气孔孔径进行评分，并且重复治疗至少三次。数据表示为从单因素方差分析得到的平均值±SE

图2.目镜千分尺和台式千分尺

食谱

MES/KCl缓冲液，pH6.15（500ml） 1.86375g 50mM KCl
5.549mg 0.1mM CaCl 2 v/v 1.066g 10mM Mes-KOH（pH6.15）
在室温下储存并使用一周

致谢

这项工作得到中国国家科学基金会（拨款号31170370）和中央大学基础研究基金（拨款号GK200901013）的支持。该协议改编自以前发表的论文He （2013）。

参考文献

He，J. M.，Ma，X. G.，Zhang，Y.，Sun，T. F.，Xu，F. F.，Chen，Y. P.，Liu，X.和Yue， Galpha蛋白，过氧化氢和一氧化氮在紫外线B诱导的气孔关闭中的作用和相互关系植物生理 161（3）：1570-1583。