图1.主轴角度测量原理。测量主轴极坐标，然后计算主轴角度alpha。

材料和试剂

固定电池
抗体
例如，对于有丝分裂纺锤体极，使用针对γ-微管蛋白抗体的抗体（克隆AK-15）（例如Sigma-Aldrich，目录号：T3320）
对于使用针对α-或β-微管蛋白的抗体（克隆TUB 2.1）（例如Sigma-Aldrich，目录号：T4026）的有丝分裂纺锤体，
与Alexa Fluor555（Life Technologies，Invitrogen TM，目录号：A21429）偶联的抗兔
抗小鼠偶联Alexa Fluor 488（Life Technologies，Invitrogen TM，目录号：A11029）
注意：初级（AK-15和TUB 2.1）和次级（抗兔偶联Alexa Fluor ^® 555和抗小鼠偶联Alexa Fluor ^® ）抗体在1x PBS/1％BSA中稀释1,000倍后使用。
10x PBS（Life Technologies，Invitrogen TM，目录号：AM9625）
4'，6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）（Sigma-Aldrich，目录号：D9542）
BSA（Sigma-Aldrich，目录号：A4503）
1x PBS（请参阅配方）
1x PBS/1％BSA（参见配方）

设备

我们使用具有63x Plan-Apochromat 1.4油透镜的Zeiss Axioimager Z1和使用带网格投影照明（apotome）的Axiocam Mrm相机。该系统由Axiovision软件驱动。图像也可以从任何共聚焦显微镜/广场显微镜+解卷积获得
12毫米圆形盖玻片（＃1.5）
玻璃滑槽
Vectashield支架介质（Vector Laboratories，目录号：H-1000）或ProLong Gold（Life Technologies，Invitrogen TM，目录号：P36934）

软件

Axiovision软件
开源软件ImageJ 1.47q（ http://rsbweb.nih.gov/ij/index.html ）
用于主轴角度测量的宏

程序

使用上述抗体并根据以下方案使用纺锤体极和有丝分裂纺锤体的染色细胞
1. 在12mm圆形盖玻片（＃1.5）上生长的细胞在-20℃下在MeOH中固定5分钟
2. 在1×PBS中再水化5分钟，并在1×PBS/1％BSA中在室温下饱和至少30分钟。
3. 在室温下与在1x PBS/1％BSA中的一抗孵育2小时。
4. 在1×PBS/1％BSA中洗涤几秒钟后，将细胞与偶联于荧光团和DAPI的第二抗体（以染色DNA，DAPI以0.5μg/ml使用）在1×PBS/1中温育1小时％BSA。
5. 在1×PBS/1％BSA中洗涤3次后，使用Vectashield 或ProLong Gold将盖玻片安装到载玻片上。
成像分析
1. 使用63x/100x PLAN APO镜头采集Z堆栈。使用Nyquist/Shannon准则进行Z步进计算（对于该透镜为0.24μm）。图像质量必须足够好，才能清楚地识别极点。
2. 确保采集软件校准图像（即体素大小包含在图像元数据中）。如果没有，宏将请求校准图像。 XY像素大小可以从（物理相机像素大小*相机像素化）/（物镜放大倍率*镜头放大倍数）导出。
3. 将Macro文本保存到ImageJ目录中的Macro子文件夹中的3Dangle.txt文件中。使用插件>宏>安装安装宏。选择点选择工具（如果选择多点选择工具，右键单击切换）。双击点工具图标以选择自动选项。或者，运行宏一次（插件>宏> 3Dangle）。
4. 使用步骤B3中指示的点选择工具集，点击两个主轴极点。然后运行宏（插件>宏> 3Dangle）。宏使用结果表的前两行来计算角度。计算的角度在日志窗口中指示。然后，结果表被清除。
宏
运行（"点工具..."，"标记= 0自动测量标签选择=黄色"）;
运行（"设置测量..."，"重定向=无十进制= 3"）;
IsCalibratedImage（）;
x1 = getResult（"X"，0）;
y1 = getResult（"Y"，0）;
z1 = getResult（"Slice"，0）;
x2 = getResult（"X"，1）;
y2 = getResult（"Y"，1）;
z2 = getResult（"Slice"，1）;
xmag1 = x1;
ymag1 = y1;
zmag1 = 0;
xmag2 =（x1-x2）;
ymag2 =（y1-y2）;
zmag2 =（z1-z2）;
//scalar product
product =（xmag1 * xmag2）+（ymag1 * ymag2）+（zmag1 * zmag2）;
//幅度水平矢量1（点1-到（0,0，z1）
length1 = sqrt（xmag1 * xmag1 + ymag1 * ymag1 + zmag1 * zmag1）;
//magnitude vector 2（points 1-2）
length2 = sqrt（xmag2 * xmag2 + ymag2 * ymag2 + zmag2 * zmag2）;
degrees = acos（product/length1/length2）;
打印（"3d角是"+度+"度"）;
运行（"选择无"）;
运行（"清除结果"）;
exit（）;
}

function IsCalibratedImage（）
{
um ="um";
getVoxelSize（width，height，depth，unit）;
if（unit =="pixels"|| unit =="micron"|| unit =="micron"）
              {
              if（width == 0 || width == 1）
                          {
                          Dialog.create（"Image Calibration："）;
                          Dialog.addMessage（"图像必须校准\ n请输入以下参数"）;
                          Dialog.addNumber（"x，y pixel size："，0，3，5，um）;
                          Dialog.addNumber（"Z step："，0，3，5，um）;
                          Dialog.show（）;
                          XYscale = Dialog.getNumber（）;
                          Zscale = Dialog.getNumber（）;
                          n = n切片;
                          run（"Properties ..."，"channels = 1 slices = n frames = 1 unit = um pixel_width ="+ XYscale +"
                          pixel_height ="+ XYscale +"voxel_depth ="+ Zscale +"frame = [0 sec] origin = 0,0"）;
                         返回;
                       }
              }
}

食谱

1x PBS
通过稀释10x PBS在MilliQ水中制成
1×PBS/1％BSA
通过向1×PBS中加入1％（重量/体积）制成

致谢

该协议改编自：Bompard等人（2013）。 GB得到"Fondation pour la RechercheMédicale"（蒙彼利埃大学2）的资助。这项工作得到了一个授权MEGAPAK到NM从ANR（Agence Nationale pour la Recherche）GENOPAT支持。

参考文献

Bompard，G.，Rabeharivelo，G.，Cau，J.，Abrieu，A.，Delsert，C.and Morin，N.（2013）。 P21激活激酶4（PAK4）是中期主轴定位和锚定所必需的。 Oncogene 32（7）：910-919