材料和试剂

大鼠尾胶原I（Life Technologies，Invitrogen TM，目录号：A10483）
胎牛血清（FBS）
Pen-Strep
Hanks平衡盐溶液（HBSS）（Life Technologies，Gibco ，目录号：14065）
E.Z.N.Z Total RNA Kit I（Omega Bio-Tek，目录号：R6834-01）
BME-酚蓝
二甲苯
10x RPMI 1640培养基（Life Technologies，Gibco ，目录号：31800-022）（参见Recipes）
4.2％NaHCO 3（参见配方）
胶原酶P（Roche，目录号：11213857001）（参见配方）
100x大豆胰蛋白酶抑制剂（STI）（Sigma-Aldrich，目录号：T6522）（参见配方）
2,000x地塞米松（Dex）（Sigma-Aldrich，目录号：D4902）（参见配方）
3D培养基（见配方）

设备

离心机（Beckman Coulter，型号：GS-15R或等价物，转子S4180）
标准5％CO 2组织培养孵化器
24孔组织培养板
37℃摇床
6厘米培养皿
解剖剪刀
15毫升塑料螺旋盖管
层流罩
摇台
组织处理器
聚丙烯网（105μm&500μm尺寸）（Spectra/Mesh）（Fisher Scientific，目录号：146436和146418）
注意：将网格切成10 x 10厘米的方块，高压灭菌。
均质器离心柱（Omega Bio-Tek，目录号：HCR003）
Tissue-Teck Biopsy Uni-cassette（Sakura，目录号：4087）
Falcon管（15ml和50ml）
Nanodrop分光光度计

程序

以下程序为一个小鼠胰腺

注意：

所有程序在层流罩中在无菌条件下进行。
对于每个胰腺，准备30ml冷HBSS + 5％FBS和20ml HBSS + 30％FBS。

准备24孔组织培养板（你将需要250微升胶原混合每孔）
1. 在冰上，以0.9ml胶原：0.1ml 10x RPMI 1640培养基的比例混合大鼠尾胶原。每1ml混合物中加入80-100μl4.2％NaHCO 3（通常为浅粉色/淡黄色）。
  注意：应对每批胶原测试并调整NaHCO的量
2. 将每个24孔板在冰上，吸取250微升胶原凝胶混合物到每个孔，确保凝胶覆盖每个孔的底部。重复，以便有一个单独的板的每一天的收获。盖上并置于37℃，5％CO 2培养箱中至少1小时以固化。
分离细胞
1. 根据制度IACUC协议牺牲每只小鼠。
2. 将小鼠放在仰卧位的解剖板上，用70％乙醇喷雾，打开腹腔暴露胰腺。
3. 切除胰腺，并置于〜20毫升的HBSS在6厘米的培养皿在冰上。旋转洗涤，倾析液体。
4. 加入5毫升冷HBSS，并用解剖剪刀迅速切碎胰腺
5. 将胰腺材料转移到15毫升塑料螺旋盖管。添加100微升10毫克/毫升胶原酶P的组织悬浮液，轻轻混合
6. 在帽子周围包裹石蜡膜并在37℃振荡器中以225rpm振摇15-20分钟，直到大多数组织块消失并且悬浮液看起来混浊（每5分钟通过眼睛检查以防止过度消化或消化不足）。
7. 加入5ml冷HBSS + 5％FBS并在4℃下离心2,000rpm，2分钟。吸出上清液。
8. 在5ml冷HBSS + 5％FBS中重新研磨沉淀3次，以1500rpm旋转，漂洗之间2分钟。
9. 最后一次洗涤后，将沉淀重悬在5ml HBSS + 5％FBS中
10. 用无菌剪刀，剪切1000微升移液器吸头的尖端，使开口更宽，然后轻轻地吸取细胞悬液通过无菌的500微米网格。
11. 吸取额外的5毫升HBSS + 5％FBS，以洗涤所有剩余的细胞通过网
12. 重复步骤：将细胞悬浮液通过105μm网孔
13. 缓慢吸取细胞悬浮液在含有20ml HBSS + 30％FBS的50ml管的顶部
14. 离心1,000 rpm，2分钟，4°C颗粒单个腺泡簇。
15. 吸出上清液。
电镀细胞
1. 在3D培养基中以8-10ml（根据胰腺的大小调整体积）重悬细胞沉淀。
2. 如上步骤A1混合胶原。
3. 混合等份的细胞悬浮液和胶原蛋白混合物。
4. 立即将细胞悬液置于胶原包被的孔中，0.5ml /孔（参见图1）
  
  图1. 3D文化设置
5. 允许胶原细胞混合物在37℃，5％CO 2下固化约1小时，然后加入1ml温热的3D-培养基（含或不含生长因子抑制剂）。
6. 在第1天和第3天更换培养基。对于Kras 表达腺泡细胞，在第5天应形成超过90％的导管囊肿（参见图2）。类似地，在铺板后提供50ng/mlTGFα的野生型腺泡细胞在第5天将形成导管囊肿，转化率为约70％-80％（参见图2）（Shi等人。 >，2013）。
  
  图2. 3D文化中的胰腺腺泡细胞
RNA /蛋白制备从腺泡细胞3D文化
1. 在1x HBSS（室温）中稀释胶原酶P（10mg/ml）1:50。在每个样品的15 ml falcon管中制备4 ml溶液
2. 用1x HBSS洗涤培养基中的细胞/胶原盘一次。用刮刀将胶原盘转移到15 ml falcon管中。池3或4井一起获得足够的细胞
3. 在37℃振荡器中，以250rpm，将胶原蛋白消化约30分钟。每10或15分钟检查一次。
4. 在所有胶原消化后，在4℃以2,000rpm离心细胞2分钟
5. 取出上清液，用1ml冷HBSS重悬细胞，并转移到1.5ml离心管中
6. 在4℃下以5,000rpm离心2分钟。小心取出上清液。通过用指尖轻轻摇动管的底部，松开颗粒。
7. 选项1：RNA制备。按照E.Z.N.A. 总RNA迷你Kit协议。使用均化器柱匀化。将最终的RNA重悬在40μlddH 2 O中。使用nanodrop分光光度计测量RNA浓度。储存于-20°C。
8. 选项2：蛋白制备。制备100μl4x样品缓冲液（BME-苯酚蓝）+ 1:50蛋白酶抑制剂混合物+ 1:100磷酸酶抑制剂混合物1 + 1：100磷酸酶抑制剂混合物2 + 1:200 Na 3 VO + sub> 4 。通过吸取和声波处理细胞15秒。储存于-20°C。
胶原盘固定
1. 在室温下用10％中性缓冲福尔马林在孔中固定胶原盘30分钟，然后使用黄色200μl移液管吸头将盘与板壁分离，并将盘转移到含有10％中性缓冲福尔马林的闪烁瓶中。在室温下在摇床上固定过夜。
2. 将固定的胶原盘从闪烁瓶转移到标准活检盒中。
3. 通过在70％，90％和100％EtOH中然后在室温下在玻璃容器中的二甲苯中孵育来逐渐脱水胶原盘，在摇摆平台上对于每种溶液孵育2小时1次。
4. 在二甲苯清除后，将盒转移到组织处理器的石蜡罐中。让胶原盘经历石蜡培养的最后两个步骤（每个在65℃下1小时），然后将它们保持在石蜡槽中，直到制备石蜡块为止。
  1. 重要事项：保持纸盒水平或者凝胶会"流入"角落，很难嵌入
  2. 胶原盘可以通过自动组织处理器处理。然而，处理器内部的溶液的新鲜度（清洁度）极大地影响结果（当处理器中的溶液变老时，胶原盘将是硬的并且收缩）。用小体积的新鲜溶液手动处理将使胶原盘在加工后保持其原始形状

食谱

10x RPMI 1640培养基
将1包RPMI 1640粉末溶解在100ml ddH 2 O中加入2g NaHCO 3，pH为7.2 过滤灭菌
存储在4°C
每2个月清新溶液
4.2％NaHCO 3/v/v 将4.2g NaHCO 3溶解在100ml ddH 2 O中。
过滤灭菌
存储在4°C
胶原酶P
溶解在10ml ddH 2 O中以制备10mg/ml原液
过滤灭菌，分装并储存于-80℃ 解冻每个腺泡制备新的小瓶
100x大豆胰蛋白酶抑制剂（STI）
溶解在ddH 2 O中以制备10mg/ml原液
过滤灭菌，分装并储存在-20°C
2,000x地塞米松（Dex）
将25mg溶于12.5ml的100％EtOH中以产生2mg/ml原液
等分并存储在-20°C
3D培养基
RPMI 1640
1％FBS
1％Pen-Strep
0.1 mg/ml STI
1μg/ml Dex

致谢

该协议改编自Shi等人。（2013）。

参考文献

Apte，M。和Wilson，J。（2005）。保持联系的重要性：调节外分泌胰腺中的细胞 - 细胞接触。 Gut 54（10）：1358-1359。
Means，A.L.，Meszoely，I.M.，Suzuki，K.，Miyamoto，Y.，Rustgi，A.K.，Coffey，R.J.，Wright，C.V.，Stoffers，D.A。和Leach，由腺泡细胞转分化和巢蛋白阳性中间体的产生介导的胰腺上皮可塑性。 em> Development 132（16）：3767-3776。
Rukstalis，J.M.，Kowalik，A.，Zhu，L.，Lidington，D.，Pin，C.L。和Konieczny，S.F。（2003）。 Connexin32的外分泌特异性表达依赖于碱性螺旋 - 环 - 螺旋转录因子Mist1。 a> J Cell Sci 116（16）：3315-3325。
Shi，G.，DiRenzo，D.，Qu，C.，Barney，D.，Miley，D.and Konieczny，S。（2013）。维持腺泡细胞组织对于防止Kras- 诱发腺泡化生。癌基因 32（15）：1950-1958。