材料和试剂

小鼠
多聚甲醛（TAAB，目录号：P001/1）
蔗糖
戊二醛（Polysciences，目录号：111-30-8）
乙醇
环氧丙烷
LR White（伦敦树脂，中型）
过氧化氢
ImmunoSaver（Nisshin EM，目录号：333）
明胶
吐温20
乙酸乙烯酯
蒸馏水或Milli-Q水
一抗
10-nm金共轭二抗（我们从Tsuru等人的EY实验室购买，2013）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（见Recipes）
0.1 M磷酸盐缓冲液（pH 7.2）（参见配方）
抗原检索溶液（参见配方）

设备

蠕动泵
冰箱
冰柜
UV辐照器（Nisshin EM，型号：TUV-100），用15W紫外光
金格（Maxtaform HR25）
超薄切片机（Leica Microsystems，型号：Ultracut UCT）
金刚石刀（Diatome AG，目录号：ultra 45）
孵化器
微波（Nisshin EM，目录号：MWF-2）
电子显微镜（日立，型号：H-7100）

程序

样品制备
1. 通过灌注固定整个小鼠。
  1. 用PBS（冰冷）或PBS中的4％多聚甲醛（冰冷的）设置由针，管，蠕动泵和烧杯组成的灌注系统。
  2. 麻醉小鼠和手术暴露心脏。
  3. 将针插入左心室，并在右心房中打孔。
  4. 通过用PBS（冰冷）灌注（8ml/min）从小鼠中除去血液
  5. 通过用含4％多聚甲醛的PBS（冰冷的）灌注（8ml/min）固定小鼠
2. 隔离冒号，切成小块（约1.5毫米厚）。
3. 再次用0.1％戊二醛和4％多聚甲醛在0.1M磷酸盐缓冲液（pH 7.2）中在4℃固定2小时。
4. 用含有8％蔗糖的0.1M磷酸盐缓冲液（pH7.2）洗涤样品
5. 用如下的一系列乙醇脱水样品
  1. 25％乙醇，在4℃下10分钟
  2. 60％乙醇，-30℃下30分钟，
  3. 80％乙醇，-30℃下30分钟
  4. 99％乙醇，-30℃下30分钟
  5. 99％乙醇，RT下10分钟
  6. 100％乙醇，两次更换，每次10分钟，在室温下
6. 为了促进树脂的渗透，如下用环氧丙烷除去乙醇。
  1. 乙醇 - 环氧丙烷（2:1），室温下10分钟
  2. 乙醇 - 环氧丙烷（1:1），室温下10分钟
  3. 乙醇 - 环氧丙烷（1:2），RT下10分钟
  4. 环氧丙烷，室温下20分钟
7. 使树脂通过浸渍如下浸入样品中。
  1. 环氧丙烷LR含白色促进剂（3：1），室温下2小时
  2. 环氧丙烷LR含白色促进剂（1：1），室温下2小时
  3. 环氧丙烷LR含白色促进剂（1:3），室温下2小时
  4. LR白色含促进剂，室温下12小时
8. 在室温下在UV照射下聚合树脂两天
9. 用超薄切片机切割嵌入的样品（90nm厚），并安装在未涂层的金网格（300目）上。
免疫染色
1. 用3％（体积/体积）过氧化氢在室温处理切片30分钟，以暴露表位
2. 用蒸馏水清洗切片。
3. 用抗原回收溶液在微波下在95℃下以2秒的间隔处理切片15分钟
4. 用0.1％明胶在PBST（含有0.05％Tween 20的PBS）中在37℃封闭切片30分钟
5. 反应切片，用PBST在室温下稀释一次抗体过夜
6. 用PBST洗涤切片三次，每次10分钟
7. 反应切片用10-nm金共轭的二抗在PBST稀释2小时在室温
8. 用PBST洗涤切片两次，每次10分钟
9. 用蒸馏水洗涤切片两次，每次5分钟
10. 在室温下用4％乙酸双氧铀染色10分钟
11. 用蒸馏水清洗切片。
12. 用电子显微镜观察切片。

食谱

磷酸盐缓冲盐水（PBS）
将2.89g的Na 2 HPO 4·12H 2 O，0.2g的KH 2 PO 4·6H 2 O， 4，8.0g NaCl和0.2g KCl的蒸馏水中将最终体积调整为1,000 ml
高压灭菌
灭菌
0.1M磷酸盐缓冲液（pH 7.2）溶液A：将13.61g KH 2 PO 4溶解在1,000ml蒸馏水中
溶液B：在1,000ml蒸馏水中溶解17.8g Na 2 HPO 4·2H 2 2H 2 O
混合适当体积的溶液A和溶液B，以将pH调节至7.2
抗原检索溶液
用蒸馏水稀释ImmunoSaver 200倍

致谢

这项工作由日本科学促进会（JSPS）KAKENHI批准24228002,24248019（KK）和14580699（AT），日本教育，文化，体育，科学和技术部（MEXT）KAKENHI 格兰特19058010（KK），上原纪念基金会（KK），武田科学基金会（KK），三菱基金会（KK）。

参考文献

Tsuru，A.，Fujimoto，N.，Takahashi，S.，Saito，M.，Nakamura，D.，Iwano，M.，Iwawaki，T.，Kadokura，H.，Ron，D.and Kohno， 2013）。 IRE1β的负反馈优化杯状细胞中的粘蛋白产生。 Proc Natl Acad Sci USA 110（8）：2864-2869。