材料和试剂

小鼠胚胎
胚胎心脏的4-6μm石蜡切片
4％PFA
石蜡
二甲苯（Merck KGaA，目录号：8.08691.1000）
乙醇（Merck KGaA，目录号：1.00983.1000）
PBS
小麦胚凝集素（WGA）缀合物四甲基罗丹明（Life Technologies，Molecular Probes ，目录号：W849）（1:100）
DAPI（Invitrogen，目录号：D1306）
蒸馏水
荧光封固介质（Fluoromont-G）（SouthernBiotech，目录号：0100-01）

设备

切片机
荧光显微镜
湿度室

软件

图像分析软件（Image J）

程序

将胚胎固定在4％PFA中并包埋在石蜡中。 E16.5胚胎脱水45分钟乙醇50％，45分钟乙醇70％，45分钟乙醇80％，45分钟乙醇90％脱水45分钟乙醇和二甲苯脱水后，将石蜡包埋在石蜡中（小鼠胚胎在4℃固定ON），45分钟乙醇95％，30分钟乙醇100％，30分钟乙醇100％，30分钟二甲苯和3次取向前1小时的石蜡，一切于室温，但石蜡在65℃的炉中进行）
再水合切片（65℃20分钟，二甲苯5分钟，二甲苯5分钟，乙醇100％5分钟，乙醇100％5分钟，乙醇96％5分钟，乙醇90％5分钟，水5分钟）。
在室温下用蒸馏水洗涤5分钟三次。
用1x PBS在室温下洗涤两次，每次5分钟
在室温下在湿室中孵育WGA（1:100）45分钟
用1x PBS洗涤5分钟三次。
与DAPI（1：1,000）孵育10分钟，在室温下在潮湿的房间和在黑暗中
用1x PBS洗涤5分钟两次。
用荧光封固介质安装（在分析前在黑暗中储存在4℃）
在显微镜下拍照。
使用ImageJ分析测量细胞面积的图像。每个切片测量至少100个细胞，每个胚胎测量三个切片。下面是用WGA染色的紧密心肌的图像实例，其中测量相对面积。我们忽视了心肌和内皮细胞，这些细胞形成覆盖心肌细胞的单层细胞。测量心肌壁内的细胞

图1.用荧光团偶联的小麦胚芽凝集素（WGA）染色的E15.5 WT心脏的7μm横切面

致谢

该研究由来自西班牙经济和竞争部（MINECO）的授权SAF2010-17555，RD06/0014/0038（RECAVA）和RD06/0010/1013（TERCEL）和来自J.L.d.l.P.的EU FP7-ITN215761（NotchIT） G.L.有来自MINECO的博士研究生奖学金（FPI计划，BES-2008-002904）。

参考文献

Luxan，G.，Casanova，JC，Martinez-Poveda，B.，Prados，B.，D'Amato，G.，MacGrogan，D.，Gonzalez-Rajal，A.，Dobarro，D.，Torroja， Martinez，F.，Izquierdo-Garcia，JL，Fernandez-Friera，L.，Sabater-Molina，M.，Kong，YY，Pizarro，G.，Ibanez，B.，Medrano，C.，Garcia-Pavia，，Gimeno，JR，Monserrat，L.，Jimenez-Borreguero，LJand de la Pompa，JL（2013）。 NOTCH途径调节剂 MIB1 中的突变导致左心室非压缩性心肌病。 Nat Med 19（2）：193-201。