材料和试剂

丙酮
甲醛
DAPI
聚赖氨酸
甘油
Cytoseal 280（Richard-Allan Scientific，目录号：8311-4）
二手Qiaquick旋转柱（QIAGEN）
11.58μm玻璃珠（Whitehouse Scientific，目录号：MS0012）
KCl
NaCl
Na 2 EGTA
Triton X-100
EDTA
PIPES
2x修改的MRWB（参见配方）
DAPI染色溶液（见配方）
M9缓冲区（请参阅配方）
Tris triton缓冲液（TTB）（参见配方）

设备

标准台式微量离心机
16-载玻片染色罐（Thermo Fisher Scientific，目录号：08-810）
小铲
显微镜
玻璃容器
玻璃盖玻片
玻璃片
18 x 18毫米玻璃盖玻片
25 x 75毫米玻璃滑轨

程序

准备幼虫
1. 从包含许多鸡蛋（100+）的板子开始
2. 使用刮铲去除任何大块留下蠕虫的块。确保在使用之间火焰，所以没有蠕虫在板之间传输
3. 使用刮铲，小心地从塑料板中取代和去除琼脂。将琼脂放在16片玻璃染色罐中，保持表面有虫向上。
4. 用去离子水冲洗玻璃容器中的琼脂三次，注意水不会直接碰到琼脂。
5. 使用刮铲，将琼脂放回塑料容器中。记住哪一面朝上！
6. 在显微镜下检查，以确保没有蠕虫留在板上。如果留下了蠕虫，请重复冲洗，直到没有蠕虫留下。应该有大量的鸡蛋（100+）。
7. 将板在室温（RT）（25℃）下放置2小时
8. 检查L1幼虫是否出现。
冷冻和修复蠕虫
1. 用500μlM9缓冲液洗板，转移到1.5 ml离心管中。重复两次。
2. 旋转3,000rpm，2分钟。除去上清液，小心不要扰动底部的蠕虫。用1ml M9重悬
3. 旋转3,000rpm，2分钟。除去上清液，小心不要扰动底部的蠕虫。用500μlM9重悬
4. 转移到使用的Qiaquick旋转柱。旋转3,000rpm，盖子打开2分钟。
5. 关闭Qiaquick柱盖，将柱子和收集管分成桶。加入液氮。在加入液氮后，应尽快进行下几个步骤
6. 加200μl丙酮（-20°C）到立柱，立即旋转2000 rpm，30秒。
7. 加入200μl丙酮（-20°C）到该柱，并置于-20°C冰箱1分钟。然后旋转2000 rpm 30秒。
8. 加入200μl新鲜的MWRB /甲醛溶液（50％2x改性MRWB，5％甲醛=100μl2×改性MRWB，100μl10％甲醛），并在室温下放置1小时。然后以2,000rpm，30秒转速。
9. 加入200微升TTB和旋转2000 rpm，30秒。重复以去除所有甲醛。
10. 加入200μlDAPI染色溶液。让我们在室温下放置1小时。旋转2000 rpm，30秒。
11. 添加200微升TTB和吸管向上和向下重新悬浮在溶液中的蠕虫。转移到1.5ml离心管收集蠕虫
准备幻灯片
1. 将75μl的0.5％聚赖氨酸（在H 2 O中）加入到18×18mm玻璃盖玻片中。盖上塑料盘盖，并放置在室温至少30分钟。
2. 回收多余的聚赖氨酸。
3. 使用蒸馏水H 2 O洗涤盖玻片并风干
4. 将一滴充分悬浮的11.58μm玻璃珠（在丙酮中）加到25×75mm载玻片的处理表面上。空气干燥。
安装蠕虫
1. 添加20微升的蠕虫在TTB到盖玻片的聚赖氨酸处理的一面。在室温下放置30分钟，使蠕虫粘在盖玻片上。
2. 删除尽可能多的TTB，但在显微镜下观察这个删除步骤，以确保大多数蠕虫被粘在聚赖氨酸。
3. 加盖75微升50％甘油到盖玻片。小心从侧面去除甘油。加入50微升50％甘油到盖玻片的中间。这有助于分散过量的TTB，使得液滴更接近50％甘油。从侧面清除多余的液体。
4. 将盖玻片放在盖玻片上，并用Cytoseal 280密封。
5. 放置在玻片保持器中并冷藏，直到使用。

食谱

2x修改的MRWB
160 mM KCl
40 mM NaCl
20mM Na 2 EGTA
10mM盐酸精胺
30mM PIPES（pH7.4）
TTB（Tris triton buffer）
100mM Tris-HCl（pH7.4） 1％Triton X-100 1mM EDTA
M9缓冲区
请参阅：常见蠕虫媒介和缓冲区
DAPI染色溶液
100μlM9
100μl去离子H 2 O 2 / 0.1μl1mg/ml DAPI

致谢

该协议已经改编自Rigaut等人（1999）和Puig等人（2001）。

参考文献

Puig，O.，Caspary，F.，Rigaut，G.，Rutz，B.，Bouveret，E.，Bragado-Nilsson，E.，Wilm，M.and Seraphin，B。串联亲和纯化（TAP）方法：蛋白复合物纯化的一般程序。方法 24（3）：218-229
Rigaut，G.，Shevchenko，A.，Rutz，B.，Wilm，M.，Mann，M。和Seraphin，B。（1999）。蛋白质复合物表征和蛋白质组探索的通用蛋白质纯化方法 Biotechnol 17（10）：1030-1032