材料和试剂

在细胞核中表达GFP的分裂酵母细胞（例如来自Kalinina等人的PD31等人，2013）。
凝胶（Sigma-Aldrich，目录号：L2380）
MgCl 2 ^。 6H <2> O
CaCl 2 ^。 2H O
KCl
Na _{2 ₄}
泛酸
烟酸
肌醇
生物素
硼酸
MnSO 4
ZnSO 4 。 7H O

FeCl <2> ^。 6H <2> O

钼酸

KI

CuSO 4 ^。 5H sub 2 O

柠檬酸

爱丁堡基本培养基（EMM）（参见食谱）

设备

覆盖有Lectin的玻璃底皿（盖玻片号= 1.5且厚度为0.16-0.19的35mm皿）（MatTek，目录号：P35G-1.5-14-C）。具有基于扫描仪的FRAP系统的透射盘共聚焦显微镜/>

我们使用安道尔革命旋转盘系统（安道科技），由横河CSU-X1旋转磁盘扫描头（横河电机）组成，连接到奥林巴斯IX81倒置显微镜（奥林巴斯）。显微镜配备有Prior ProScanIII xy扫描台（Prior Scientific，Rockland MA，USA）和Olympus UPlanSApo 100x/1.4 NA油物镜（OLYMPUS）。采集和漂白的激发使用Sapphire 488nm固态激光器（50mW;相干）进行。使用Andor Revolution激光组合器（ALC，Andor Technology）中的声光可调谐滤波器控制激光功率。显微镜配备有iXon EM + DU-897 BV背照式EMCCD照相机，冷却至-80℃，前置放大增益2.4，EM增益300（安道尔技术）。所得到的图像中的xy像素尺寸为129nm 注意：在FRAP实验之前，必须在使用Andor FRAPPA校准载片的Andor iQ软件的FRAP校准程序之后进行校准。简而言之，软件引导用户通过一系列点漂移步骤，在此期间必须指示图像中的漂白点位置。这样，扫描仪漂白位置用图像中的点位置校准。

BL HC 525/30（Semrock）

光谱仪

软件

Andor iQ2软件（Andor技术）

斐济（ http://fiji.sc/Fiji ）

Matlab（MathWorks）软件

程序

将5ml预培养的细胞在EMM +补充物中生长晚。第二天，将细胞在20ml培养物中更新直至指数生长，其通过用19稀释1ml预培养物来进行 ml新鲜EMM（1:20）。细胞数目可以通过光密度测量在光谱仪上的测量。为了获得指数生长的细胞，应当实现OD <600> = 0.1-0.2。这将近似于a 细胞数在2×10 6个细胞/ml-1×10 7个细胞/ml之间。 OD <600> = 1，与单元格数量成线性关系。

带有玻璃底的成像培养皿用1μl凝集素（2mg/ml）覆盖，并使其干燥。

将100μl来自培养物的EMM中的细胞加入培养皿中并静置10分钟

通过凝集素粘附于培养皿的细胞用2洗涤一次 ml EMM以除去松散/未附着的细胞，并加入1.5ml EMM。

FRAP实验在室温下连续进行三次由Andor iQ2软件控制的步骤（a.b.c.见下文）。理想情况下30 - 50细胞。

Prebleach：在聚焦感兴趣的细胞后，使用488nm激光以50-15％的曝光时间以10-15％获得核的单个平面的50个图像的延时（细节参见上文，发射滤光片是BL HC 525/30）。

漂白：漂白在50％的488nm激光器的2×2正方形像素区域（在核内部，远离核仁）上进行，每个像素上的停留时间为1ms，并且2个重复（上面的细节，发射滤光片为BL HC 525/30）。

Postbleach：在漂白之后，如前所述继续成像400次，其中50nm曝光时间为488nm激光（发射滤光片为BL HC 525/30）的10-15％。
注意：在"不饱和荧光条件"（任意荧光的范围从0到255的范围内）之前，在FRAP实验之前建立适当的激光曝光时间和强度是重要的。为了具有非饱和条件下，激光器必须设置为高于0但低于255的平均饱和度），以避免过度漂白并允许荧光定量用于进一步分析。这可能意味着图片质量相当差。

分析

简而言之，绘制具有5个像素的宽度和大致等于核的长度L的长度的感兴趣区域（ROI，参见图1）。

图1.裂变酵母细胞核中GFP上的FRAP实验从左到右：表达NLS-GFP的细胞的方案和3个图像（菌株PD31，Kalinina等人，，光漂白（-2.95s），光漂白后（0s）和随后的图像（0.059s）。中间面板中的十字标记了漂白区域的中心（2 x 2像素）。沿着核绘制感兴趣区域（ROI，品红色矩形）。旁边的细胞的图像，连续图像中放大的ROI的延时序列显示GFP的恢复。右图显示了第一傅立叶模式的时间衰减。圆圈表示数据点，实线是函数 A ₁ （t） = 的三参数拟合A ₁（0）exp（-π² D t/ ）+ offset。这里， ₁是第一傅立叶模式的振幅， t 是时间，，并且 L 是漂白区域的长度。从Kalinina等人采取和修改图。。

沿着ROI的短轴对电影的每个图像上的ROI内部的强度求和。

得到的对应于连续时间点的一维荧光强度分布用于计算第一傅里叶模式的时间衰减。

从第一傅里叶模式的振幅的衰减速率计算扩散系数D，如Elowitz所描述的，其中Elowitz em>等。对于该特定示例，我们得到扩散系数 D =3.7μm²/s。

食谱

根据应变，应使用适当的介质。对于成像透明EMM是最好的（Forsburg和Rhind，2006）
对于1升溶液，称重以下组分：

3 g/L Φ Phthallate hydrogen potassium 14.7 mM

2.2 g/L
   Na ₂ HPO ₄
15.5 mM

5 g/L
   NH ₄ Cl
93.5 mM

20 g/L
  葡萄糖
2％w/v

20 ml/L
   盐（见下文，储备溶液）

1 ml/L
   维生素（见下文，储备溶液）

0.1 ml/L
   矿物（见下文，库存解决方案）

225 mg/L
   Leucin（对于PD31，其是亮氨酸的营养缺陷型）

盐：50x储液

金额
组件
最终浓度

52.5克/升
MgCl 2 ^。 6H <2> O
0.26 M

0.735g/L
CaCl 2 ^。 2H O
4.99 mM

50克/升
KCl
0.67 M

2 g/L
Na _{2 ₄} 14.1 mM

维生素：1,000x股

1 g/L
泛酸
4.20 mM

10 g/L
烟酸
81.2 mM

10 g/L
肌醇
55.5 mM

10 mg/L
生物素
40.8μM

矿物：10,000x股

5 g/L
硼酸
80.9 mM

4 g/L
MnSO 4
23.7 mM

4 g/L
ZnSO 4 。 7H O
13.9 mM

2 g/L
FeCl <2> ^。 6H <2> O
7.40 mM

0.4 g/L
钼酸
2.47 mM

1 g/L
KI
6.02 mM

0.4 g/L
CuSO 4 ^。 5H sub 2 O
1.60 mM

10 g/L
柠檬酸
47.6 mM

注意：取自并修改自： http：//www-bcf .usc.edu /〜forsburg/media.html 。

致谢

我们感谢E. Guarino和酵母基因资源中心（YGRC，日本）的菌株和质粒; MPI-CBG（德国德累斯顿）的光学显微设备进行讨论和建议; 德国研究基金会（DFG）和人类前沿科学计划提供财政支持。 M.R.C. 得到了玛丽·居里欧洲奖学金的支持。该协议改编自Kalinina等人（2013）。

参考文献

Elowitz，M.B.，Surette，M.G.，Wolf，P.E.，Stock，J.B.and Leibler，S。（1999）。大肠杆菌细胞质中的蛋白质迁移。 em> J Bacteriol 181（1）：197-203。

Forsburg，S.L。和Rhind，N。（2006）。裂殖酵母的基本方法酵母 23（3 ）：173-183。

Kalinina，I.，Nandi，A.，Delivani，P.，Chacon，MR，Klemm，AH，Ramunno-Johnson，D.，Krull，A.，Lindner，B.，Pavin，N.and Tolic-Norrelykke，IM （2013年）。微管在心轴极点周围的枢转加速了神经细胞的捕获。 15（1）：82-87。