材料和试剂

放射性配体[3 H] - 螺哌隆（例如PerkinElmer，目录号：NET565250UC）
Butaclamol（如 Sigma-Aldrich，目录号：55528-07-9）
含受体的膜悬浮液
竞争性化合物（这里使用的多巴胺HCl，例如Sigma-Aldrich，目录号：62-31-7）
Whatman GF/C过滤器（例如 PerkinElmer，目录号：6005174）
聚（乙烯亚胺）溶液（PEI）（例如Sigma-Aldrich，目录号：9002-98-6）
闪烁鸡尾酒（例如：PerkinElmer，目录号：6013641）
TRIS基地
CaCl <2>
MgCl 2
蒸馏水
抗坏血酸
测试缓冲区（参见配方）
洗涤缓冲液（见配方）
0.1％PEI（仅用于D 3受体测定）（参见配方）
NSB解决方案（参见配方）
稀释的竞争对手复合（见配方）
放射性配体溶液（参见配方）

设备

96孔板（聚苯乙烯）
细胞收集器（例如 PerkinElmer）
Ultra-Turrax（IKA，型号：0001602800）或类似的分散器
水浴
闪烁计数器

软件

Prism（Graphpad Software）或类似软件

程序

测定前

准备测定和洗涤缓冲液。
对于D 3测定：在滤板上制备0.1％PEI溶液和移液管100μl/过滤器，随后置于冰箱（4℃）中至少2小时。
在总测定体积为1,000μl（450μl测定缓冲液+200μl放射性配体+200μl测定缓冲液或5μM（+） - butaclamol +150μl膜制备物）的96孔板（聚苯乙烯）中进行实验。
准备NSB解决方案。
制备竞争性化合物（此处使用多巴胺）的稀释液。
准备放射性配体溶液
膜制备。
根据制备方案制备含受体的膜悬浮液。使用Ultra-Turrax短脉冲使小体积（<2ml）中的悬浮液再匀化。稀释至所需的蛋白质浓度，并且每48个数据点实验产生约8ml的总体积。应该选择膜悬浮液的蛋白质浓度，以便获得稳定的特异性结合信号，但同时， 10％（甚至更好地<5％）的游离放射性配体浓度。蛋白质含量可以通过多种文章来测定，例如Bradford（1976）。首先在冰中制备膜悬浮液。
预温所有解决方案，在25°C水浴中15分钟。

最后准备（表1），按以下顺序向孔中添加组分：

250μl测定缓冲液
150μl膜悬浮液
200μl竞争剂，测定缓冲液（TB）或butaclamol（NSB）。使用越来越浓的竞争对手。
200μl测定缓冲液

通过加入200μl放射性配体溶液开始反应。

表1.微量滴定板上竞争剂浓度的移液方案

TB	TB	NSB	NSB	10	10	2 x 10	2 x 10	3 x 10	3 x 10	5 x 10	5 x 10
9	9	2 x 9	2 x 9	3 x 9	3 x 9	5 x 9	5 x 9	8	8	2 x 8	2 x 8
3 x 8	3 x 8	5 x 8	5 x 8	7	7	2 x 7	2 x 7	3 x 7	3 x 7	5 x 7	5 x 7
6	6	2 x 6	2 x 6	3 x 6	3 x 6	5 x 6	5 x 6	5	5	NSB	NSB



										总计	总计

在测定期间
1. 在25℃水浴中孵育120分钟
2. 使用细胞收集器通过Whatman GF/C过滤器快速真空过滤终止反应。用冰冷的洗涤缓冲液洗涤过滤器10次
测定后
1. 将50μl放射性配体的等分试样加入计数板的孔中以测定总放射性
2. 干燥，例如。在烤箱中烤2小时。
3. 将贴纸放在底部，加入闪烁鸡尾酒（20μl）至过滤器，将贴纸置于板的顶部，并在闪烁计数器中计数，在计数样品前允许足够的时间（15分钟）。
数据分析
可以分析所获得的数据以产生几种类型的信息。应考虑以下内容。
1. 仔细检查原始数据的重复一致性，并通过消除明显的"异常值"抵制美化数据的诱惑。我们建议在这方面应该非常保守;设计良好的实验的结果不会受到单个离群值的严重影响。换句话说，如果实验的结果取决于单个数据点是否是异常值的问题，则整个实验可能已被设计和/或执行得不好，并且应该重复。
2. 在y轴上竞争剂不存在和存在下的结合量与竞争剂在x轴上的浓度的图。在这些图中，可以在低于任何测试的竞争剂浓度的虚拟浓度下进入在不存在竞争剂（总结合，TB）的情况下的结合量，以及在高于最高测试竞争剂的虚拟浓度下的非特异性结合（NSB）浓度。具有D 2受体的代表性实验可能看起来像这样
3. 对于数据分析，使用所有重复，而不进行平均是更可取的。
4. 在良好实施的实验中，竞争剂的浓度范围以如下方式选择：最低竞争剂浓度不引起任何可测量的抑制，并且最高竞争剂浓度产生接近非特异性结合的抑制程度。如果不满足这两个条件之一，则数据分析变得棘手，因为曲线拟合可能产生假值
5. 应用许多可用的数据分析软件包之一，例如
  Prism，以便为数据拟合S形曲线。在大多数这样的计算机程序中，您可以选择对解释结果参数估计有重要影响的设置。
  1. 首选方法是让曲线的顶部和底部作为软件，并检查结果值是否接近实验确定的总和非特异性绑定。
  2. 在大多数情况下，软件应该找到S形曲线的转折点，因为这将产生曲线的IC ₅₀。
  3. 曲线的斜率可以通过软件找到。接近1的值表示与单个站点的相互作用。如果斜率小于单位，则曲线是浅的，这可以指示与多个站点的交互（见下文），但不一定证明它。
  4. 如果假设与多个位点例如受体亚型的相互作用是可能的，则可以定义为曲线应该遵循单相或双相函数，每个分量具有单位斜率。在理论上，双相拟合总是产生更小的残余误差，因为存在更多的拟合参数。因此，如果通过F检验或类似的（已经在用于这种用途的大多数软件包中实现的）判断，产生显着更小的残留误差，则应当接受双相拟合。如果两相拟合优越，则它将产生两个组分的IC 50值和两个组分中的每一个的百分比。例如对于上面所示的代表性实验，数据点到拟合曲线的距离的平方和分别为24177和18221，对于单位点和两位点拟合，产生6.734的F值，其以p值0.0040指示应该拒绝零假设（优选单个位点），并且优选双位点模型。
6. 拾取双相曲线的能力取决于竞争剂对存在的两种亚型的选择性（或者如果激动剂高和低亲和力状态正在被分析，则是激动剂的固有活性）以及抑制剂浓度的数量每个浓度单位增量测试
7. 曲线拟合的结果应该总是被目视检查以检查它们是否有意义。例如，在一些情况下，计算机程序产生超出测试的竞争者浓度范围的估计。这种外推是非常不可靠的，不应该使用;而是应该重复实验，更好地选择竞争对手的浓度
8. IC 50的估计值取决于测定中放射性配体的浓度，表示为其K d值的倍数。为了获得更多信息的Ki值，IC 50的转化是必需的， Prusoff方程：
  K sub = IC 50 /（（L/K sub）+ 1）
  其中L和K d是放射性配体的浓度和亲和力注意：
  1. 由于其设计的竞争结合实验不能证明抑制剂和放射性配体之间的竞争性相互作用。这需要例如。在一种或多种抑制剂浓度不存在和存在下的饱和实验。
  2. 从对数标度获得IC 50值，来自多个实验的重复通常不在线性标度上呈现高斯分布。因此，来自多个实验的平均值应该表示为-log IC 50（或-log K sub）的平均值（具有SD）。或者，可以用（不对称的）置信区间来呈现中值IC 50或K i。线性IC ₅₀或K i 值的均值（与SD）不合适。

食谱

测定缓冲区
50mM TRIS：TRIS-HCl：6.6g和TRIS碱970mg/L（或仅6.04g TRIS碱/L）
5mM KCl：373mg/L
2mM CaCl 2 ：< 220 mg/L
2mM MgCl 2 ^。 6H 2 O：410mg/L
pH 7.4
每个测试日制备含有0.05％（25mg/50ml）抗坏血酸的新鲜缓冲液注意：该缓冲液优化用于检测受体的激动剂高亲和力状态（激动剂竞争曲线）;因此，应避免包括Na ⁺ 。如果这不在项目的范围内，则没有Mg ^{2 +} ，Ca ^{2 +} 或K ⁺
洗涤缓冲液
50mM TRIS：TRIS-HCl（33g/5L）和TRIS碱（4.85g/5L）
pH 7.4
0.1％PEI（仅用于D 3受体测定）制备0.1％溶液，PEI作为50％溶液递送，用注射器从其中移取1ml，并加入9ml水。得到5％，移取400μlPEI 5％+ 19.6ml蒸馏水得到PEI 0.1％
NSB解决方案
3.98mg丁草胺HCl/10ml测定缓冲液产生1μL。 10 M（制备其等分试样）
稀释该1:200以获得5μM的溶液，即在终浓度为1μM的最终浓度。

竞争化合物的稀释液（多巴胺用作此处的实例）

多巴胺HCl的分子量为189.6g/mol。称重3-5 mg，计算测定缓冲液达到目标浓度所需的体积; 尝试从固定的卷开始并达到特定量复合在技术上更困难。在这个例子中，必须是3.8mg 溶解在20ml测定缓冲液中以达到10μM-3μM。稀释2倍测定缓冲液达到预期最高浓度的5倍测定中，例如对于10μM-4μM的5×10 4-4μM。
在里面第一行以下方案每管放置1,800μl测定缓冲液在第3行（3x）700μl和第4行（5x）中的第2行（2x）800μl中， 500μl。如果超过一个，可能需要增加准备的金额将进行竞争实验。

稀竞争对手库存溶液以1:10步骤首先。吸取从10 ^-4200μl至 5和5,200μl至6μl等。然后，做2x，3x和5x的女儿溶液，移液管中200μl在2x，300μl在3x和500μl在5x。做这个也为8,7,6,5和4.（表2）

表2.竞争对手工作解决方案的稀释计划

5x	5x	5x	5x	5x		NSB
3x	3x	3x	3x	3x
2x	2x	2x	2x	2x
9	8	7	6	5	4

放射性配体溶液
预期的放射性配体浓度测定法在转染细胞中应当是约2-3×K d（K d subspiperone）根据对于D 2，D 3和D 3的文献≈0.05nM，0.35nM和0.07nM， D <4>）。准备的储备溶液需要是5倍测定浓度。因此，储备溶液应当为10-15×K d。的以下是基于16.2的特定活动的示例计算 Ci/mmol放射性D 2受体的放射性储备溶液测定。这需要适应基于他们的其他亚型 K d值和每批放射性配体及其比活性。每个计划的48个数据点准备约10ml的储备溶液实验。储备溶液可以在带有螺帽的50ml管中制备 [3 H] - 螺哌隆浓度= 1mCi/ml /（16.2Ci/mmol×1,000mCi/Ci）=61.7μM
所需的最高浓度（3×K d×5）= 3×0.05×5 = 0.75nM
10ml×0.75nM = 0.0075nmol [3 H] - 螺环酮需要
（0.0075nmol）/61.7×103nM=0.12μl10ml所需的[3 H] - 螺环哌啶酮溶液
因此，在83.3ml测定缓冲液中的1μl[3 H] - 螺哌隆溶液，得到浓度为0.75nM的
有关此类计算的免费工具，请访问 www.graphpad.com/quickcalcs/chemMenu/.

致谢

该协议是Levant最初发布的协议（2007）的改编。

参考文献

Bradford，MM（1976）。一种快速灵敏的微量蛋白定量定量方法蛋白染料结合的原理。 Anal Biochem 72：248-254
Levant，B。（2007）。多巴胺受体的表征。 36：1.6.1-1.6.15。
van Wieringen，J.P.，Booij，J.，Shalgunov，V.，Elsinga，P.and Michel，M.C。（2013）。多巴胺D（2）受体的激动剂高和低亲和力状态：检测和临床的方法意义。 Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 386（2）：135-154。