材料和试剂

放射性配体[3 H] - 螺哌隆（例如PerkinElmer，目录号：NET565250UC）
Butaclamol（如 Sigma-Aldrich，目录号：55528-07-9）
含受体的膜悬浮液
Whatman GF/C过滤器（例如 PerkinElmer，目录号：6005174）
聚（乙烯亚胺）溶液（PEI）（例如Sigma-Aldrich，目录号：9002-98-6）
闪烁鸡尾酒（例如：PerkinElmer，目录号：6013641）
Tris-HCl
KCl
CaCl <2>
MgCl 2
蒸馏水
测试缓冲区（参见配方）
洗涤缓冲液（见配方）
NSB解决方案（参见配方）
放射性配体溶液（参见配方）
放射性配体稀释（见配方）

设备

96孔板（聚苯乙烯）
细胞收集器（例如 PerkinElmer）
Ultra-Turrax （IKA，型号：0001602800）或类似的分散器
水浴
闪烁计数器

软件

Prism（Graphpad Software，San Diego，CA，USA）或类似的

程序

测定前

准备测定和洗涤缓冲液。
使用一些受体源PEI预处理的过滤板可以提高TB/SB比率：在过滤板上制备0.1％PEI溶液和移液管100μl/过滤器，随后置于冰箱（4℃）中至少2小时。
在总测定体积为1,000μl（450μl测定缓冲液+200μl放射性配体+200μl测定缓冲液或5μM（+） - butaclamol +150μl膜制备物）的96孔板（聚苯乙烯）中进行实验。
准备NSB解决方案。
准备放射性配体溶液。
膜制备。
根据制备方案制备含受体的膜悬浮液。使用Ultra-Turrax短脉冲使小体积（<2ml）中的悬浮液再匀化。稀释至所需的蛋白质浓度，并且每24个数据点实验产生约4ml的总体积。应该选择膜悬浮液的蛋白质浓度，以便获得稳定的特异性结合信号，但同时， 10％（甚至更好地<5％）的游离放射性配体浓度。蛋白质含量可以通过多种文章来测定，例如Bradford（1976）。首先将膜悬浮液制备成冰。
预温所有解决方案15分钟，在25°C水浴。

最后准备（表1），按以下顺序向孔中添加组分：

450μl测定缓冲液
200μl测定缓冲液（TB）或200μl5μMButaclamol（NSB）。
150μl膜悬浮液

通过加入200μl放射性配体开始反应
表1.样品在微量滴定板上的移液方案

T1	T1	T2	T2	T3	T3	T4	T4	T5	T5	T6	T6

TB1	TB1	TB2	TB2	TB3	TB3	TB4	TB4	TB5	TB5	TB6	TB6
NSB1	NSB1	NSB2	NSB2	NSB3	NSB3	NSB4	NSB4	NSB5	NSB5	NSB6	NSB6

在测定期间
1. 在25℃水浴中孵育120分钟
2. 使用细胞收集器通过Whatman GF/C过滤器快速真空过滤终止反应。用冰冷的洗涤缓冲液洗涤过滤器10次
实验后
1. 将50μl放射性配体的等分试样加入计数板的孔中以测定总放射性
2. 干燥，例如在烤箱中干燥2小时。
3. 将贴纸放在底板上。添加闪烁鸡尾酒（20微升）过滤器，贴在板的顶部，在闪烁计数器计数，在计数样品前允许足够的时间（15分钟）。
数据分析
需要进行以下计算以从数据中导出K sub 和_max。
1. 仔细检查原始数据的一致性重复。不要轻松地从数据集中消除明显的"异常值"
2. 从总结合的每个重复中减去平均非特异性结合以获得特异性结合
3. 基于放射性配体的比放射性和闪烁计数器的效率，将测定中的放射性配体的摩尔浓度和测量的结合值（总结合，非特异性结合和特异性结合）转化至配体的摩尔量。具有D 2受体的代表性实验可能看起来像这样
4. 绘制特异性结合（y轴）与放射性配体浓度（x轴）
5. 通过非线性迭代曲线拟合使用矩形双曲线函数，使用许多可用的迭代曲线拟合程序之一来分析数据，例如Prism。
6. 可以校正组织含量的摩尔量的B max，主要是每孔蛋白质的量（主要产生fmol/mg蛋白质）;例如组织湿重，细胞数或DNA含量的替代标准化
7. 作为内部质量检查，确定测定中总放射性的总结合的分数。这需要< 10％（更好地<5％），否则可能存在非平衡条件。在后一种情况下，如果测量的信号保持稳定，则可以降低测定中的膜浓度。或者，可以增加测定体积，因为这将增加放射性配体的总量（浓度常数），而不是结合的量（膜蛋白量恒定）。
8. 在过去，当没有计算机辅助数据分析时，使用Rosenthal曲线（更好地称为Scatchard曲线）估计K sub和B max max（Rosenthal发明了它们，但是Scatchard使它们著名）。在这些图中，特异性结合的放射性配体在x轴上，并且相对于在y轴上结合/未结合的放射性配体的比例绘图。 x截距对应于B max，并且斜率的负倒数对应于K sub。 Rosenthal/Scatchard图仍然可用于可视化数据点确实落在线性线上，但是从中导出的估计比来自迭代曲线拟合的估计更不可靠（在这些图中使用的线性回归的假设不满足，因为x和y不是彼此独立的），使得这是过时的分析
9. 如果在抑制剂不存在和存在下进行饱和结合实验，则数据可用于测试抑制剂的竞争性质。如果抑制剂的存在改变放射性配体的K sub而不是B sub max/Sub。，则是这种情况。

食谱

测定缓冲区
50mM TRIS：TRIS-HCl：6.6g和TRIS碱970mg（或仅6.04g TRIS碱/L）
5mM KCl：373mg/L
2mM CaCl 2：220mg/L
2mM MgCl 2（6H 2 O）：410mg/L
pH 7.4
洗涤缓冲液
50mM TRIS：TRIS-HCl（33g/5L）和TRIS基质（4.85g/5L）（或仅30.22g/5L TRIS基质） pH 7.4
0.1％PEI（仅用于D 3受体测定）制备0.1％溶液，PEI作为50％溶液递送，用注射器从其中移取1ml，并加入9ml水。为了得到5％，移取400μlPEI 5％+ 19.6ml蒸馏水得到PEI 0.1％
NSB解决方案
3.98mg丁草胺HCl/10ml测定缓冲液产生1μL。 10 M（制备其等分试样）
稀释该1:200以获得5μM的溶液，即在测定中的最终浓度为1μM
放射性配体溶液
应当选择测定中的预期放射性配体浓度范围以覆盖预期的K d和约5-10x K d（K d spiperone）在根据文献的转染细胞中分别对于D 2，D 3和D 4分别为≈0.05nM，0.35nM和0.07nM）。待制备的储备溶液需要为测定浓度的5倍。因此，储备溶液应为25-50×K d。以下是基于对于D 2 O 2受体测定的放射性储备溶液的比活度为16.2Ci/mmol放射性的示例计算。基于它们的K d值和每批放射性配体及其比活性，这需要适应其它亚型。
[3 H] - 螺哌隆浓度= 1mCi/ml /（16.2Ci/mmol×1,000mCi/Ci）=61.7μM
所需的最高浓度（10×K d×5）= 10×0.05×5 = 2.5nM
2.5ml x 2.5nM = 0.00625nmol [3 H] - 螺环酮需要
（0.00625nmol）/61.7×103 nM =0.1013μl2.5ml所需的[3 H] - 螺哌隆溶液
因此，在25.0ml测定缓冲液中的1μl[3 H] - 螺哌隆溶液，得到2.5nM的浓度。
有关此类计算的免费工具，请访问 www.graphpad.com/quickcalcs/chemMenu/ 。

放射性配体稀释（超过100倍范围）（表2）
表2.放射性配体工作溶液的稀释方案

号码	相对浓度	准备
1	100	2.5 ml最高浓度的放射性配体
2	66.67	混合800μl从管1 +400μl测定缓冲液
3	50	混合1000微升从管1 + 1000微升测定缓冲液
4	25	混合1000微升从管3 + 1000微升测定缓冲液
5	12.5	从试管4 +1000μl测定缓冲液混合1000μl
6	6.25	混合1000微升从管5 + 1000微升测定缓冲液

致谢

该协议是Levant最初发布的协议（2007）的改编。

参考文献

Bradford，M.M。（1976）。利用蛋白质染料结合原理的快速灵敏的微克量蛋白定量方法。 Anal Biochem 72：248-254
Levant，B。（2007）。多巴胺受体的表征。 36：1.6.1-1.6.15。
van Wieringen，J.P.，Booij，J.，Shalgunov，V.，Elsinga，P.and Michel，M.C。（2013）。激动剂多巴胺D 2受体的高亲和力和低亲和力状态：检测方法和临床意义。 Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 386（2）：135-154。