材料和试剂

细胞培养用于脂质分析。当分析表达硫酯酶的细菌培养物时，建议等待直至后期固定期（大肠杆菌的8-24小时）进行提取以允许足够的时间用于产物积累（Lennen et al。，2013）
十七酸甲酯（纯度> 99％）（例如Sigma-Aldrich，目录号：51633）
GC样品瓶（VWR International，目录号：46610-722）（确保您购买的样品瓶与您使用的任何自动进样器兼容）
压缩氮气/调节器/管道
反渗透水
甲醇
绝对（100％）乙醇
高分辨气相色谱级己烷（99.9％纯己烷异构体混合物）
冰乙酸（Thermo Fisher Scientific，目录号：A38-212）
去离子水
无水1.25M HCl的甲醇溶液（Sigma-Aldrich，目录号：17935）
碳酸氢钠
0.5M甲醇钠的甲醇溶液（Sigma-Aldrich，目录号：403067）
氯仿
适当的内部标准（例如非天然的奇数链脂肪酸）。一些可能性包括：
1. 十七酸（C17：0）（99％+纯）
2. 十五烷酸（C15：0）（99％+纯）
3. 1,2-二十五酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺的氯仿溶液（99％+纯）（Avanti Polar Lipids，目录号：850704）
外部标准（希望在已知浓度下定量的脂肪酸的甲基酯，通常这些可以从商业来源获得）。有用的外标混合物由Supelco通过Sigma-Aldrich（目录号：18918-1AMP）出售
Antifoam 204（Sigma-Aldrich，目录号：A8311）

设备

5 ml玻璃移液管
将具有氟聚合物内衬帽（Thermo Fisher Scientific，Kimble ^TM，目录号：73802）的10ml玻璃离心管（Thermo Fisher Scientific，Kimble ，目录号：73785-10） -15415）
手套
Goggles
根据当地法规
处理合适的个人防护装备
化学通风橱
离心机
涡流搅拌器
真空源/抽吸设备
冻干机
水浴
质谱仪或火焰离子化检测器
Agilent 7890 GC，带有30 m x 0.25 mm HP 5-ms毛细管柱

程序

在玻璃离心管中收集2.5ml细胞培养物（该体积足以用于大肠杆菌的后期指数/固定相培养物）。
注意：大多数塑料管与氯仿不兼容，将在后续步骤中添加。
注意：
1. 如果您想将测量的脂肪酸浓度标准化为细胞密度，请在此刻记录OD <600> 。
2. 如果你的文化产生游离脂肪酸，大量的泡沫可能积聚。有必要塌陷泡沫，因为存在于培养物中的游离脂肪酸的显着部分可以在泡沫中。这可以通过加入消泡剂，随后在85℃水浴中孵育5-10分钟来完成（Lennen等，2013）。例如，在Lennen等人中添加200μl的在消泡剂204的乙醇中的1:10稀释液以塌陷50ml摇瓶培养物的泡沫。 2013。
向细胞培养物中加入〜50μg适当的内标。在该过程的过程中，该内标的一部分将丢失。根据其已知的起始浓度和存在的最终量，最终提取物中每种脂肪酸甲酯的测量浓度可用于测定培养物中相应酸的浓度。内标的选择取决于期望在待分析的样品中富含的脂肪酸。通常细胞不产生大量的奇数链脂肪酸。例如，E。在葡萄糖上生长的大肠杆菌不产生大量的奇数链脂肪酸，因此十七烷酸（C17：0）可以用作内标。
1. 如果测量膜脂肪酸或长链游离脂肪酸（C 16 16 -C 18物质），5μl溶于乙醇中的10mg/ml十七烷酸是有用的内部标准。
2. 如果感兴趣的菌株产生大量（0.5g/L或更高）的中链游离脂肪酸（Lennen等人，2013; Youngquist等人， 2012; Lenen等人，2010），将50μl溶解在乙醇中的10mg/ml十五酸（C15：0）用作内标。
3. 如果仅分析磷脂种类，则可以使用磷脂内标，例如氯仿中的1,2-二十五烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺代替游离脂肪酸标准（Lennen和Pfleger ，2013）。
4. 请注意，对于您的特定系统，可能需要调整为内部标准品的体积/浓度给出的所有值，根据要定量的脂肪酸的链长度，可能需要使用不同的标准品。内标应当尽可能接近地模拟待定量的化合物，并且应该以接近（相同的顺序）的量加入收集的培养物样品中幅度）它将用于分析的化合物的浓度
5. 如果在步骤14中进行两次0.5ml己烷提取，则5μl10mg/ml将对应于50μg/ml十七烷酸甲酯的理论最终浓度。这与C14：0，C16：0大约相同的数量级，和从野生型E的膜回收的C16：1脂肪酸。大肠杆菌。
加入100微升冰醋酸酸化培养物。小心涡旋样品混合。这应在化学通风橱下进行
用玻璃移液管加入5毫升体积比为1:1的氯仿和甲醇混合物（氯仿将从塑料移液管中浸出各种化合物）。彻底涡旋。
注意：
1. 该混合物可以储存在-80℃，并且如果需要，提取（下面详述）在稍后的日期完成。
2. 如果样品已冷冻，则应将每个样品解冻至室温，然后再进行第5步。
以1,000 x g离心每个样品10分钟。
使用真空管或吸气器，去除上层水层和界面处的所有细胞碎片注意：
1. 如果存在内标物，则可以吸入少量的底部氯仿层。
2. 在吸入之前，确保为此过程产生的废物提供适当的容器。
3. 如果需要，氯仿层可以在-80℃下储存。
4. 此步骤应在化学通风橱下进行！
在氮气流下蒸发氯仿提取物，在管中留下干燥的残余物。
注意：
1. 通常有一些残留的水，在该步骤后难以除去。
2. 如果将管从-80°C冰箱中解冻，则在进行蒸发步骤之前，应重新吸入任何积聚的水滴。
3. 此步骤应在化学通风橱下进行！
冻干残余物（30-60分钟就足够了）以除去任何残留的水。所有后续步骤都需要用无水样品进行
对于总脂肪酸提取（游离脂肪酸和通过酸催化的结合脂肪酸种类）：
向干燥的提取物中加入0.5ml无水1.25M HCl的甲醇溶液。盖上盖子，在50℃下加热过夜注意：
1. 或者，该程序可以在75-80℃进行1小时。
2. 升高的温度会在密封的小瓶中产生压力，因此，如果您这样做（设备部分中描述的那些是足够的），请确保您有能够承受这些条件的管。
3. 此步骤应在化学通风橱下进行！
将管冷却至室温。
加入0.5ml高分辨气相色谱级己烷。由于己烷挥发性高，所以要小心快速地工作。此步骤应在化学通风橱下进行！
加入5ml的100mg/ml NaHCO 3水溶液（该浓度接近溶解度极限，在搅拌过夜或温和地温热溶液后，其将溶解）。加入碳酸氢盐猝灭酸催化的反应。此步骤应在化学通风橱下进行！

对于通过碱催化的结合（磷脂）脂肪酸提取：
向干燥的氯仿提取物中加入0.5ml 0.5M甲醇钠的甲醇溶液。此步骤应在化学通风橱下进行！
在50℃下将反应孵育10分钟，这足以用于常见磷脂例如在E中发现的磷脂的酯交换。大肠杆菌。
注意：
1. 该反应也可以用于酯交换其他结合的脂肪酸，例如在三酰基甘油中发现的那些。
2. 关于这些反应的孵育时间的指导，其不同于磷脂所需的时间，参考例如William Christie的脂质分析（Lipid Analysis）的资源（Christie和Han，2010）。不允许反应进行得比所需更长，因为反应时间太长，并且水的存在可导致游离脂肪酸的酯化。
3. 如前所述使用游离脂肪酸内标可以告知是否仅结合的脂肪酸被甲基化。
4. 此步骤应在化学通风橱下进行！
将管冷却至室温。通过加入0.1ml冰醋酸，然后加入5ml去离子水淬灭反应。此步骤应在化学通风橱下进行！
加入0.5ml高分辨气相色谱级己烷。此步骤应在化学通风橱下进行！

对于结合和总脂肪酸提取：
将管彻底涡旋并在室温下以1,000×g离心10分钟以产生稳定的界面。注意，水相在进行之前应该是澄清的。
在合适的气相色谱小瓶中从第一次萃取中收集0.4ml己烷层。确保盖住样品瓶以防样品蒸发。此步骤应在化学通风橱下进行！
向甲醇：水提取物中加入0.5ml高分辨率气相色谱级己烷进行第二次提取。充分涡旋混合并在室温下以1,000×g离心10分钟以产生稳定的界面。这一步应在化学通风橱下进行！
收集0.5ml的上层己烷层并加入到在步骤14中收集的己烷中。收集的己烷层准备进行GC分析。
注意：
1. 如果脂肪酸浓度超出标准校准曲线的范围，样品可能需要在己烷中稀释。
2. 此步骤应在化学通风橱下进行！
使用质谱仪或火焰离子化检测器通过气相色谱分析。明智的做法是随机排列样品的运行顺序，以防止在分析中引入偏差。以下是使用具有30m×0.25mm HP 5-ms毛细管柱的Agilent 7890 GC（Lenen等人，2010）的用于细菌脂质的典型气相色谱方法的实例：
1. 使用1:10分流比的氦载气注入1μl（较低的分流比，例如 1：100，可用于更丰富的物种）。
2. 烘箱温度100℃，2分钟
3. 烘箱温度150℃，4分钟
4. 以4℃/min的速率升温至250℃。
如果您想了解有关脂质分析的更多信息，一个非常有用的参考资料是网站 http：//lipidlibrary.aocs。 org/index.html。在第19步中给出了一个有真实数据的例子。
要确定色谱样品中目标脂肪酸甲酯的浓度，您需要以各种已知浓度（外部标准）运行这些化合物的样品，跨越未知样品中每种化合物的全部浓度范围。运行这些样品后，您将有一组峰面积和每个化合物的相应浓度。然后，您可以构建每个化合物（包括您的内部标准）的最佳拟合曲线，并计算样品中每种脂肪酸甲酯的浓度和内标。这些浓度应乘以理论值与实际内标浓度的比值，以校正萃取和甲基化过程中样品损失。然后可以测定细菌培养物中的浓度。请记住，脂肪酸甲酯的质量单位的浓度，需要校正以报告相应脂肪酸的浓度。在分析期间以摩尔单位工作是明智的。作为一个经验法则，你应该期望 R ²值约为0.98至0.99或更高
从表达对12个碳（C12）饱和的酰基-ACP具有特异性的植物硫酯酶的细菌培养物中提取脂质，导致C12亚游离脂肪酸和在较小程度上过量产生C14游离脂肪酸。在如上所述通过酸催化将510μg十五烷酸（C15）加入2.5ml后固定相培养物中并进行总脂肪酸提取方案后，通过GC-MS分析所得的FAME。在萃取中使用总共1ml的己烷。通过构建将每种物质的峰面积与其浓度（表1的第2列）相关的校准曲线，确定色谱样品中存在的C12，C14和C15 FAME的量。如果C15酸向其甲酯的转化及其随后的提取是完美的，则在色谱样品中将存在539.5μg/ml的C15甲酯（从列出的分子量计算）。该事实用于调节C12和C14FAME的浓度（测量的浓度乘以比率539.5/484.3）。然后使用这些校正的浓度通过使用分子量转换为酸浓度，然后除以培养物样品的体积（2.5ml）来确定培养物中的脂肪酸滴度。

表1.使用十五烷酸（C15：0）作为内标通过GC-MS测量表达硫酯酶的培养物中的C12和C14脂肪酸的滴度。通过色谱法分析样品，而滴度指培养物中的浓度。分子量从NIST化学书籍获得。

笔记

氯仿有毒，只能在通风橱下使用。如果氯仿与胶乳或丁腈手套接触，请立即脱下手套。或者，在使用氯仿时，请使用聚乙烯醇或SilverShield手套。
此程序使用腐蚀性（冰醋酸和甲醇中的无水盐酸），水敏感性以及易燃（甲醇和己烷）化学品。甲醇钠在甲醇中是易燃的，通过吸入，摄入和与皮肤接触具有高毒性。所有这些都应根据通用的化学品安全规范进行处理。

致谢

这里描述的协议是基于Bligh和Dyer（1959）的工作。该协议是由美国能源部，大湖生物能源研究中心资助开发的。

参考文献

Bligh，E.G。和Dyer，W.J。（1959）。总脂质提取和纯化的快速方法。 Can J Biochem Physiol 37（8）：911-917
Christie，W. W.和Han，X。（2010）。脂质分析：分离，分离，鉴定和脂质组学分析，Oily Press Bridgewater，UK
Lennen，R. M.和Pfleger，B. F.（2013）。调节膜组成改变大肠杆菌中的游离脂肪酸耐受性。 a> PLoS One 8（1）：e54031。
Lennen，R.M.，Politz，M.G.，Kruziki，M.A.and Pfleger，B.F。（2013）。在大肠杆菌中鉴定与游离脂肪酸流出有关的转运蛋白。 J Bacteriol 195（1）：135-144。
Lenen，R.M.，Braden，D.J.，West，R.A.，Dumesic，J.A。和Pfleger，B.F。（2010）。微生物碳氢化合物合成的过程：大肠杆菌中的脂肪酸过量生产和催化转化为烷烃。 Biotechnol Bioeng 106（2）：193-202
NIST化学WebBook，NIST标准参考数据库编号69，Linstrom，PJ和Mallard，WG（eds。） http：//webbook.nist.gov/chemistry 。
Youngquist，J.T.，Lennen，R.M.，Ranatunga，D.R.，Bothfeld，W.H.，Marner，W.D.，2nd和Pfleger，B.F。（2012）。基于连续培养的大肠杆菌中的游离脂肪酸生产的动力学模型的质粒自由菌株。 Biotechnol Bioeng 109（6）：1518-1527。