材料和试剂

牛细胞（TBL3细胞系来源于自发性牛-B淋巴肉瘤细胞系BL3的体外感染，用Hissar股票新戊型肝炎病毒感染）
RPMI 1640（Gibco）
胎牛血清（热灭活）
青霉素/链霉素
纤连蛋白（Sigma-Aldrich，目录号：F1141）
甲醛（Sigma-Aldrich，目录号：F8775）
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：T9284）
SVF（PAA Laboratories GmbH，目录号：A15-101）
BSA（Sigma-Aldrich，目录号：A2153）
小鼠单克隆抗Ki67（1:50）（Abcam，目录号：ab10913-1）
Cy2 AffinyPure抗小鼠IgG（1：5,000）（Jackson ImmunoResearch Laboratories，目录号：715-225-150）
Tween 20（Biosolve，目录号：2045 2335）
ProLong Gold Antifade Reagent with Dapi（Life Technologies，Invitrogen TM，目录号：P-36931）
DAPI

设备

程序

牛细胞在补充有10％热灭活的胎牛血清，4mM L-谷氨酰胺，25mM HEPES，10μMβ-巯基乙醇的RPMI 1640中培养。和100μg/ml青霉素/链霉素的DMEM培养基中在37℃的湿润的5％CO 2气氛中培养。
在24孔板中，用PBS-纤连蛋白（1/1000）包被载玻片，在37℃下2小时，并用PBS洗涤两次。
将非粘附牛细胞（24孔板中的500,000个细胞/孔）在37℃，5％CO 2下接种在纤维连接蛋白包被的载玻片上2小时，然后固定在500μlPBS 3.7％甲醛中15分钟min。
将载玻片在PBS（300μl-3次洗涤）中漂洗并用PBS 0.2％Triton X-100透化5分钟。
将载玻片在PBS（300μl-3次洗涤）中洗涤，然后在室温下用250μlPBS 1％SVF和1％BSA封闭30分钟以防止非特异性染色。
将载玻片与小鼠单克隆抗Ki67（1:50）在100μlPBS 1％SVF和1％BSA中在室温下温育40分钟。
在PBS 0.2％吐温（300μl-3次洗涤）中洗涤后，将载玻片与在100μlPBS 1％SVF和1％BSA中的Cy2 AffinyPure抗小鼠IgG（1：5,000）在室温下温育30分钟，黑暗。
随后将载玻片在PBS 0.2％吐温（300μl-3次洗涤）中洗涤，安装在载玻片上，并用带有DAPI的ProLong Gold Antifade试剂盖上盖子。
用连接到荧光显微镜的照相机拍摄免疫荧光染色的图像，并计算Ki67阳性细胞的百分比。
对三个独立的生物学重复（图1）重复该染色

图1.牛细胞的Ki67染色

致谢

该协议改编自James 等人（2005）。 Weitzman实验室由Fondation de France（FdF＃2102），癌症协会（ARC Fixe＃4975，ARC-Equipement＃7990）和国际癌症研究协会（AICR，＃08-0111）支持。

参考文献

James，D.，Levine，A.J.，Besser，D。和Hemmati-Brivanlou，A。（2005）。 TGFbeta/activin/nodal信号是维持人胚胎干细胞多能性所必需的。 a> 132（6）：1273-1282。
Marsolier，J.，Pineau，S.，Medjkane，S.，Perichon，M.，Yin，Q.，Flemington，E.，Weitzman，M.D.and Weitzman，J.B。（2013）。 OncomiR成瘾由miR-155反馈回路产生，其中转化的白细胞。 PLoS Pathog 9（4）：e1003222。