材料和试剂

异氟烷（Isosol）（Vedco，目录号：50201）
不含脂肪酸（FA）的牛血清白蛋白（Sigma-Aldrich，目录号：85041C）
cOmplete TM ULTRA蛋白酶抑制剂片剂，无EDTA（Roche，目录号：0589253001）
OptiPrep TM密度梯度介质（Sigma-Aldrich，目录号：D1556）
Bradford试剂（Bio-Rad，目录号：500-0001）
甘露醇（Sigma-Aldrich，目录号：M4125）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（见配方）
1 M Tris-HCl（参见配方）
0.5 M EDTA（见配方）
缓冲区M（参见配方）
缓冲液M + 0.45％FA游离BSA +蛋白酶抑制剂（参见配方）
缓冲液M +蛋白酶抑制剂（参见配方）

设备

10毫升一次性塑料注射器（热密封）用200微升吸头
使用本生灯，加热并部分熔化200μl移液管尖端的宽端。在塑料有时间硬化之前，快速地将200μl移液管尖端的熔化端插入一次性塑料10ml注射器的鲁尔管。让组件冷却，并通过注射器/尖端组件在高压下运行10ml水来检查密封的紧密性。
夏普重型夹层责任剪刀
安乐死瓶
平衡和塑料重物船
镊子
1ml具有松散和紧密杵的玻璃匀浆器（Kimble Chase Kontes）（Fisher Scientific，目录号：885300-0001）
台式冷冻离心机
Ultrafuge
Thinwall，Ultra-Clear TM 5ml 13×51mm超滤管（Beckman Coulter，目录号：344057）
SW55Ti转出转子（Beckman Coulter，型号：342194）
移液器
50ml圆锥形

程序

制备
1. 将以下物品放在冰上：
  1. 均化器+杵（那些应放置在冰上的50ml锥形）
  2. 50ml缓冲液M + 0.45％BSA + cOmplete ^TM
  3. 50ml缓冲液M + cOmplete ^TM。
2. 将以下物品转移到冷藏室：
  所有的项目放在冰上。
  1. 移液器
  2. 移液器提示
  3. 镊子
  4. 小桶水冲洗杵
  5. 为SW55Ti摆出水桶
  6. UltraClear SW55Ti管
  7. OptiPrep
3. 设置动物解剖区域：
  1. 安乐死室与异氟烷
  2. 重型剪刀
  3. 10ml装有PBS的注射器
  4. 小型塑料称重托盘放在冰上
  5. 镊子
程序开始

图1.使用差速离心从小鼠脊髓中纯化线粒体的程序
1. 在安乐死室中使用异氟烷终止麻醉小鼠。
2. Cervicaly脱臼动物，断头并在髂嵴（恰好在臀部上方）切断脊柱。使用装有PBS的10ml注射器从脊柱冲洗脊髓。插入尖端在脊柱的尾部开口，并弹出约5毫升的PBS。这将从被切断的脊柱的嘴端冲出脊髓。如果无法实现脊髓的清洁冲洗，请将前柱下方的背柱分段，并重复冲洗程序。在这种情况下，请确保保存脊髓小块中脊髓导致的前肢下方切割片。在除去多余的PBS后，将脊髓置于置于冰上的小塑料称重盘中
3. 快速称重脊髓，将其放回冰上。
4. 步骤B5到B18都在寒冷的房间里进行。
5. 在冷室中工作时，用冰镊在1ml玻璃匀浆器中在冰上转移脊髓。加入10体积的缓冲液M + 0.45％FA游离BSA + cOmplete TM sup （例如，如果脊髓重60mg，加入600μl缓冲液）。
6. 使用冷却的松散杵，用10-15次敲击轻轻匀浆冰上的组织（刚好足以完全解离组织）。避免形成气泡。
  注意：在匀浆过程中产生气泡可导致细胞内膜破裂和蛋白质变性，应避免这两种情况，以减少对线粒体的损害。
7. 使用紧杵在15次敲击下轻轻匀浆冰上的组织。避免形成气泡。
8. 在4℃下1,000×g离心5分钟，并将上清液（S1）转移到冰上的新管中。
  注意：在此步骤产生的1,000×g上清液主要由具有重和轻膜的胞质溶胶组成。颗粒含有大部分未破裂的细胞和核。
9. 将沉淀（P1）重悬在10体积的缓冲液M + 0.45％FA游离BSA + cOmplete TM中，并使用紧杵轻轻匀化15x。避免形成气泡。
  注意：此步骤用于从剩余的未破裂细胞中进一步释放细胞质和细胞内细胞器。
10. 在4℃下1,000×g离心5分钟，并将所得上清液（S1）与来自步骤8的上清液（S2）混合。
11. 在4℃下以1,000×g离心混合的上清液5分钟。
  注意：此步骤确保任何污染的未破坏的细胞或细胞核从细胞质/细胞内膜亚细胞部分去除。
12. 收集上清液（S3），保持离开沉淀并在4℃下以12,000xg旋转10分钟。
13. 用200μlOptiPrep TM和600μl缓冲液M + 0.45％FA游离BSA + cOmplete TM制备Beckman UltraClear TM 管。混合好，存放在冰上。
14. 弃去从步骤B12得到的上清液（S4），并使用在150μl缓冲液M + 0.45％FA游离BSA + cOmplete TM缓冲液中轻轻（但彻底）重悬沉淀（P4）。
  注意：在此步骤产生的12,000xg上清液主要由具有光膜的细胞溶质组成。沉淀物主要包含重的细胞内膜（线粒体）。
15. 一旦沉淀物完全重悬，将其全部（记录最终体积）转移到在步骤B13中制备的Beckman UltraClear TM管中。用缓冲液M + 0.45％无游离BSA + cOmplete TM补充以使终体积为1ml，并用1ml移液管轻轻（但彻底）混合。
16. 将UltraClear TM 管转移到SW55Ti在冰上摆动的桶中，并使用高速离心机以17,000×g（相当于13,400rpm）在SW55Ti转子中离心管4℃17分钟（除去断裂）。
  注意：将重膜级分在OptiPrep梯度中离心以从重膜制备物中除去大部分污染物（例如髓磷脂和内质网）。 UltraClear ^TM管可以重复使用，如果在使用后清洗（没有洗涤剂），并保存干燥。
17. 轻轻地从水桶中取出管，将它们放在冰上。使用温和抽吸除去上清液，包括顶部白色层。
18. 轻轻地将沉淀（P5）重悬在1ml缓冲液M + cOmplete TM（未完全分散）中，并在4℃以12,000×g离心10分钟。
  注意：在OptiPrep梯度后，将重膜悬浮在不含BSA的缓冲液M中，以便洗去前述步骤中的BSA，以更准确地测量步骤B20中的蛋白质浓度。
19. 通过用你的手指轻轻地轻拂管，并尽快放回冰上，重悬在10-20微升缓冲液M + cOmplete ^TM中的沉淀（P6）。在进行蛋白质定量之前，确保沉淀物完全重悬注意：重要的是以高浓度重悬浮重膜，因为这减少对细胞器的损伤。通过轻弹重悬细胞器还可以减少细胞器损伤。
20. 使用Bradford测定法对1μl重悬浮的沉淀估计蛋白质量。一旦确定蛋白质浓度，使用4.5％FA游离BSA原液将最终浓度为0.45％无游离BSA添加到悬浮液中，以避免稀释制剂。
  注意：在蛋白质定量后，将无游离的BSA加回到重膜制备物中，以允许通过减少细胞器的解偶联来更好地保持线粒体活性。理想地，线粒体活性（氧消耗）应当在制剂的一部分上测量，以确定细胞器的质量和在制备过程中可能持续的损伤。

食谱

PBS（1 L）
开始用800毫升蒸馏水
加入8克NaCl
加入0.2g KCl
加入1.44g Na 2 HPO 4
加入0.24g KH 2 PO 4 sub/
用HCl
调节pH至7.4 加入蒸馏水至总体积为1 L
1M Tris-HCl，pH7.4（500ml）将60.57g的Tris碱与400ml的dH 2 O混合当Tris碱用浓HCl溶解pH至7.4时用dH 2 O完全达到500ml
储存在4°C
0.5M EDTA，pH8.0（500ml）将73.06g EDTA与400ml dH 2 O混合使用浓KOH将pH调节至8.0 用dH 2 O完全达到500ml
储存在4°C
缓冲液M（500ml）
混合19.1 g 的甘露醇加入到400ml的dH 2 O中加入11.9g蔗糖
加入5ml的1M Tris-HCl pH7.4 加入1ml 0.5M EDTA pH 8.0/v 用dH 2 O完全达到500ml
过滤灭菌（0.22μm）
储存在4°C
注意：隔离程序之前，请先准备食谱5和6。
缓冲液M + 0.45％FA游离BSA +蛋白酶抑制剂 50ml缓冲液M + 0.225g FA游离BSA + 1片cOmplete TM蛋白酶抑制剂（在4℃下储存）
缓冲液M +蛋白酶抑制剂
50ml缓冲液M + 1片cOmplete TM蛋白酶抑制剂（在4℃下储存）

致谢

该协议改编自Parone等人（2013）和Vande Velde等人（2008）。

参考文献

Parone，P.A.，Da Cruz，S.，Han，J.S.，McAlonis-Downes，M.，Vetto，A.P.，Lee，S.K.，Tseng，E.and Cleveland，D.W。（2013）。增强线粒体钙缓冲能力可减少错误折叠的SOD1和运动神经元细胞死亡的聚集，而不会延长小鼠模型的生存期的遗传性肌萎缩性侧索硬化。 J Neurosci 33（11）：4657-4671。
Vande Velde，C.，Miller，T.M.，Cashman，N.R.and Cleveland，D.W。（2008）。错折叠的ALS连锁突变型SOD1与线粒体细胞质面的选择性关联。 em> Proc Natl Acad Sci USA 105（10）：4022-4027。