材料和试剂

水稻原生质体
质粒pUN1301-EGFP-ABD2-EGFP（Yang等人，2011）
D-甘露醇（Sigma-Aldrich，目录号：M1902）
2-（N-吗啉代）乙磺酸（MES）（Merck KGaA，目录号：475893）
纤维素酶"Onozuka"RS（Yakult Pharmaceutical Industry，目录号：9012-54-8）
Macerozyme R-10（Yakult Pharmaceutical Industry，目录号：8032-75-1）
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A1933）
氯化钙（CaCl 2）（Sigma-Aldrich，目录号：C5670）
β-巯基乙醇（Merck KGaA，目录号：444203）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S5886）
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P5405）
氯化镁（MgCl 2）（Sigma-Aldrich，目录号：M2393）
PEG4000（Merck KGaA，目录号：817006）
Murashige和Skoog基础盐混合物粉末（MS）（Sigma-Aldrich，目录号：M5524）
消化缓冲液（参见配方）
W5缓冲区（见配方）
Mmg缓冲区（参见配方）
聚乙二醇溶液（见配方）

设备

35μm尼龙网
旋转盘共聚焦显微镜，配备有使用512×512 Andor iXON电子倍增的 Yokogawa CSU-X1旋转盘头 CCD相机（ Andor ）
振动器
离心机
凹形滑动（直径15mm）（Beyotime，目录号：FSL011）
配备100x 1.4 NA UPLSAPO（通用计划超级消色差物镜）物镜的Olympus BX61倒置显微镜
488 nm激光
525/50 nm带通滤波器

软件

安道IQ2软件（可从 http://www.andor.com 获取）

程序

用2.5％NaClO和0.01％Tween-20消毒水稻种子15分钟，用灭菌水洗涤种子5次，然后用2.5％NaClO将种子灭菌15分钟，用灭菌水冲洗种子5次。最后将这些种子放在灭菌的滤纸上并干燥
在28℃下在半强度MS培养基上在黑暗中发芽和生长灭菌的水稻种子14天。
切割叶鞘的叶鞘为0.5-1.0毫米长度，立即浸入消化缓冲液中消化组织在黑暗中28℃下轻轻摇动（40-80 rpm）4小时。除非另有说明，以下所有步骤均在室温下操作。
向上述混合物中加入一体积的预冷却W5缓冲液，并通过用35μm尼龙网筛选未消化的组织在冰上收集原生质体。
通过在4℃下300分钟旋转5分钟来收集原生质体，并将原生质体重悬在新鲜的W5缓冲液中。
收获沉淀，并用Mmg缓冲液将原生质体稀释成2×10 6个细胞/ml。
为了转化，将20μg质粒pUN1301-EGFP-ABD2-EGFP加入到100μl原生质体中，然后加入等体积的聚乙二醇溶液。将混合物在室温下温育20分钟
加入10体积的W5缓冲液，并在300×g离心5分钟，收获原生质体。
用新鲜的W5缓冲液重新悬浮沉淀，并在黑暗中孵育原生质体20小时
用移液管将原生质体装入凹形载玻片（直径15mm）中，并用盖玻片覆盖。在装备有100×1.4NA的Olympus BX61倒置显微镜下观察肌动蛋白丝的动力学 UPLSAPO目标。图1显示了典型的稻原生质体中肌动蛋白丝的组织

图1.典型的水稻原生质体中肌动蛋白丝的组织。用质粒pUN1301-EGFP-ABD2-EGFP转化该原生质体。比例尺=10μm。
使用配备有使用512×512 Andor iXON电子倍增CCD照相机的Yokogawa CSU-X1旋转盘头的旋转盘共聚焦显微镜收集图像。使用488nm激光激发GFP，并使用525/50nm带通滤光片收集荧光发射。使用Andor IQ2以100msec的时间间隔收集延时Z系列图像（具有0.5μm的台阶），并且整个Z系列收集的时间间隔为5秒。将Z-堆叠图像制成电影以在典型的稻原生质体中显示肌动蛋白丝（见视频1）。

视频1.Z-堆叠图像的视频在含有pUN1301-EGFP-ABD2-EGFP的典型稻原生质体中显示肌动蛋白丝。每0.5μm取图像，并压缩成2.8s- 视频。比例尺=10μm。
丝的切断频率定量为每单位时间的断裂次数（单位长度/断裂/μm/s），解聚速率通过在给定时间间隔（μm/s）内的起酥油长度计算，。表1列出了我们的一个结果示例。

表1.水稻原生质体中丝的切断频率和解聚速率

切断频率（断裂/μm/s）
0.0165±0.0080 （ n = 15）

解聚速率（μm/s） 0.0023±6.58e-4 （ n = 20）

在携带质粒pUN1301-EGFP-ABD2-EGFP的稻原生质体中与单肌动蛋白动力学相关的参数的定量。使用超过15个原生质体进行分析。给出的值是平均值±SE。

食谱

消化缓冲区
0.6 M甘露糖 10 mM MES pH 5.7
1.5％纤维素RS
0.75％macerozyme R10
0.1％BSA
1mM CaCl 2
5mMβ-巯基乙醇

W5缓冲区
154 mM NaCl 125mM CaCl 2。 5 mM KCl
2 mM MES

Mmg缓冲区
0.6 M甘露糖 15mM MgCl 2·h/v 4 mM MES

聚乙二醇溶液
0.6 M甘露糖 100mM CaCl 2
40％v/v PEG 4,000

致谢

该协议改编自我们以前公开的工作（Shi等人，2013年）。我们感谢Meng Shi和Shaojie Cui对水稻原生质体制备和转化提出了有益的建议。黄实验室的研究由科技部（2013CB945100）和国家自然科学基金（31125004）资助。

参考文献

Shi，M.，Xie，Y.，Zheng，Y.，Wang，J.，Su，Y.，Yang，Q.and Huang，水稻肌动蛋白相互作用蛋白1是水稻生长所必需的肌动蛋白周转。植物J 73（5）：747-760。

Yang，W.，Ren，S.，Zhang，X.，Gao，M.，Ye，S.，Qi，Y.，Zheng，Y.，Wang，J.，Zeng， Huang，S。和He，Z。（2011）。 BENT UPPERMOST INTERNODE1 编码II类formin FH5对肌动蛋白组织至关重要，水稻发育。植物细胞 23（2）：661-680。