材料和试剂

注意：所有的工作都应该在无RNA酶的环境中进行，只使用无菌，无RNase的解决方案和材料。

E。含有SR45 cDNA的大肠杆菌 BL21（DE3）-pLysS宿主细胞
体外转录的RNA
纯化的重组蛋白
Cap类似物（New England Biolabs，目录号：S1404S）
SP6聚合酶（Fermentas，目录号：EP013120U /μl）
rNTPs
ATP（Fermentas，目录号：R0441）
CTP（Fermentas，目录号：R0451）
GTP（Fermentas，目录号：R0461）
UTP（Fermentas，目录号：R0471）
RNase抑制剂（Life Technologies，Invitrogen TM，目录号：10777019）
32 P-UTP-尿苷5'三磷酸（PerkinElmer，目录号：BLU007C001）
HEPES（Thermo Fischer Scientific，目录号：AC172571000）
KCl（Sigma-Aldrich，目录号：P9541）
MgCl 2（Mallinckrodt，目录号：5958-04）
甘油（Thermo Fischer Scientific，目录号：G331）
Triton X-100（Thermo Fischer Scientific，目录号：BP151）
十二烷基硫酸钠（SDS）（Mallinckrodt Baker，目录号：4095-02）
NaCl（Thermo Fischer Scientific，目录号：7647-14-5）
（Mallinckrodt，目录号：7917-04）。
（Thermo Fischer Scientific，目录号：7778-77-0）
亚精胺（Sigma-Aldrich，目录号：52626）
硫酸肝素（Sigma-Aldrich，目录号：H4784）
Tris碱（AMRESCO，目录号：77-86-1）
丙烯酰胺/双丙烯酰胺（Bio-Rad Laboratories，目录号：16105B）
苯酚：氯仿（AMRESCO，目录号：0883）
过硫酸铵（APS）（Gibco BRL ，目录号：5523UA）
TEMED（VWR International，目录号：97064-684）
溴酚蓝（Sigma-Aldrich，目录号：161-0404）
二甲苯Cyanol（Sigma-Aldrich，目录号：X4126）
pGEM载体（Promega，目录号：P2161）
异丙基-β-D硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）（Gold Bio，目录号：I2481C5）
氨苄青霉素（VWR International，目录号：IB02040）
S-蛋白琼脂糖珠（Merck KGaA，Novagen ，目录号：80031-014）
溶菌酶（Sigma-Aldrich，目录号：L6876）
pET32c载体（Merck KGaA，Novagen ，目录号：69017-3）
蛋白酶抑制剂混合物（Sigma-Aldrich，目录号：P9599）
硼酸（Mallinckrodt，目录号：2549-04）
乙二胺四乙酸（EDTA）（Thermo Fischer Scientific，目录号：S311-500）
乙酸铵（Thermo Fischer Scientific，目录号：A637-500）
牛血清白蛋白（BSA）
LB培养基
5x凝胶移位缓冲液（参见配方）
裂解缓冲液（见配方）
10x TBE（参见配方）
凝胶混合（见配方）
5％变性凝胶（见配方）
5％无变性凝胶（见配方）
TNS解决方案（参见配方）
尿素凝胶的RNA加载染料（参见配方）
用于非尿素凝胶的6x装载缓冲液（参见配方）
结合/洗涤缓冲液（参见配方）
磷酸盐缓冲液（参见配方）
柠檬酸缓冲液（见配方）

设备

1.5ml微量离心管（BioExpress，目录号：C-3262）
Saran换装
Whatman过滤纸
水浴（VWR International，型号：1225 PC）
具有电源的电泳设备（Thermo Fisher Scientific，型号：B2容易成本）
凝胶干燥设备（Savant System LLC，型号：SGD 2000）
Phosphorimager（Molecular Dynamics，型号：Storm 840）
荧光屏（Molecular Dynamics，型号：1000004864）
Sonicator（SP Scientific，型号：274480）
0.45微米注射器过滤器（Life Science Products，目录号：25CSO80AS）
离心机（Eppendorf，型号：022620401）
垂直凝胶装置（Gibco BRL ，型号：V15.17）
液体闪烁计数器
轨道振动器

程序

注意：我们常规地通过使用含有对应于感兴趣的RNA的DNA的线性化pGEM克隆体外转录产生RNA探针。 pGEM载体具有T7和SP6启动子。取决于插入DNA的取向，T7聚合酶或SP6聚合酶用于体外转录以产生RNA探针。

使用体外转录系统制备RNA
1. 在1.5 ml微量离心管中制备以下反应。将1μlDNA模板（约1μg线性化的质粒DNA），1μl10x RNA聚合酶缓冲液，1μlrNTP（5mM ATP，CTP，0.5mM GTP，UTP），1μl盖帽类似物（5mM） 45μCi）：a- 32 P-UTP（800Ci/mmol; 10mCi/ml），0.5μlRNA酶抑制剂和1μlSP6聚合酶，总共10μl反应物。 >
2. 孵育37℃，3至6小时（注1）。
3. 加入90μldH 2 O至10μl总计100μl
4. 加入等体积（100μl）的苯酚/氯仿，涡旋混合
5. 旋转16,000英寸x g 5分钟。
6. 将上层转移到一个新的Eppendorf（〜100微升）
7. 加入33μl10M乙酸铵和250μl100％乙醇到100μl
8. 在-80℃孵育10分钟。
9. 旋转16,000英寸x g 10分钟。
10. 用500μl80％乙醇洗涤沉淀。
11. 空气干燥颗粒; 重悬于10μlRNA加载染料中
12. 在90℃下加热1分钟
13. 加载在5％变性丙烯酰胺凝胶上，运行一到两个小时，取决于RNA的大小（注2）。
14. 拆卸凝胶室并拆除凝胶，将其安装在一块板上。为了便于在下面的步骤A16中凝胶与X射线胶片的对准，切割凝胶的一个角
15. 用Saran包装包裹凝胶以避免污染。
16. 将凝胶暴露于X射线胶片2-5分钟，并显影该胶片以显现放射性带
17. 将凝胶对准X射线胶片的顶部，并找到凝胶上对应于胶片上放射性带的区域。
18. 切除相应于X射线胶片上的条带的凝胶（见图1和注释3和4）。
  
  图1. 在图2a和2b中使用的体外转录的RNA 。将凝胶暴露于X射线胶片后，鉴定适当大小的RNA产物，切下凝胶对应于条带并用于提取RNA
19. 将切除的带转移到400微升TNS溶液在Eppendorf管中，并在室温下孵育过夜。
20. 第二天，取出TNS溶液，其中含有放射性标记的RNA，加入等体积的苯酚/氯仿，涡旋混合。
21. 旋转16,000英寸x g 10分钟。
22. 用500μl80％乙醇洗涤沉淀。
23. 干燥沉淀; 将RNA沉淀重悬于20μlH 2 O中
24. 使用液体闪烁计数器测量1μlRNA中的放射性，并使用此数值计算RNA探针中标记的"U"残基的浓度（注5）。
25. 用RNA酶自由水稀释RNA探针至50至100 K cpm /μl，用于EMSA检测
重组蛋白的制备和纯化
对于除RNA之外的EMSA分析，需要纯化的目的蛋白。可以通过将cDNA克隆到细菌表达载体中来产生这种蛋白质。这里，我们在大肠杆菌中表达 SR45 作为S.tag融合体，并使用S-蛋白琼脂糖珠纯化。
1. 成长。在含有氨苄青霉素的LB培养基中将含有SR45 cDNA的大肠杆菌BL21（DE3）-pLysS宿主细胞在37℃下过夜。第二天将1ml过夜培养物接种到含有适当抗生素的100ml LB培养基中，然后培养直至OD 600达到〜0.6（大约需要2小时）。
2. 通过加入IPTG至终浓度为0.5mM诱导重组蛋白的表达，并使细菌培养物在30℃下再生长4小时。
3. 通过在4℃下以2,350×g离心10分钟收获细菌细胞
4. 弃去上清液，并在50mM Tris-HCl pH 8.0,2mM EDTA的1/10培养物体积（5ml）中重悬细胞沉淀。
5. 加入溶菌酶至100μg/ml的浓度; 使用在50mM Tris-HCl pH 8.0,2mM EDTA中新鲜制备的10mg/ml储备液。然后加入1/10体积（0.5ml）的1％Triton X-100。在30℃孵育15分钟。
6. 将管放置在冰浴中，超声4次（3.5设置），每次15秒。
7. 在4℃下以12,000xg离心15分钟。上清液含有可溶性蛋白质
8. 通过0.45微米的膜过滤上清液
9. 在Eppendorf管中加入100μl结合/洗涤缓冲液到100μlS蛋白琼脂糖浆中，轻轻混合，然后加入1 ml步骤8中的可溶性蛋白（注释6）。
10. 混合并在定轨振荡器上室温孵育30分钟。（不要剧烈摇动，因为这可能会使蛋白质变性）。
11. 在4℃下以500×g离心10分钟，小心地倾析上清液，并用结合/洗涤缓冲液洗涤珠粒，每次5次，每次1ml。
12. 将含有结合蛋白的洗过的珠子重悬于150μlpH2的0.2M柠檬酸缓冲液中
13. 在室温下孵育10分钟，每隔几分钟轻轻混匀
14. 通过加入8μl2M Tris-碱（pH 10.4）中和。
15. 洗脱的蛋白质对磷酸盐缓冲液（注7）透析
电泳迁移率变动分析（EMSA）
在设置反应前，制备5％非变性（天然）凝胶，并使用1×TBE缓冲液在200V预运行凝胶10至15分钟。
1. 在1.5ml微量离心管中制备以下反应混合物（终体积14μl）。 1.5μl1mM亚精胺（100mM），3μl5×凝胶移位缓冲液，0.5μlRNA酶抑制剂，1μl放射性标记RNA（50-100Kcpm），xμl裂解缓冲液（取决于蛋白质体积）和x μl的目的蛋白质（注8）
2. 在30℃孵育5分钟。
3. 加入1μl硫酸肝素（50mg/ml）（注9）
4. 将反应物转移到冰上5分钟
5. 加入3微升6倍尿素的加载缓冲液
6. 将反应产物装载在5％非变性凝胶上，并在200V运行2至3小时或者为了良好分离（通常对于约200nt的RNA探针，将运行2小时）（注10）。
7. 将凝胶转移到Whatman滤纸上，用Saran包裹物覆盖，并用凝胶干燥设备干燥
8. 干燥的凝胶应该暴露于荧光成像屏2小时至过夜
9. 游离RNA和RNA - 蛋白复合物通过使用phosphorimager显现（见图2a和2b）
  
  图2.RNA EMSA。 A。 EMSA与使用纯化的重组蛋白的RNA探针。泳道1，游离探针;泳道2-5，增加重组蛋白的浓度。 B.通过冷RNA竞争重组蛋白与RNA探针的结合。泳道1，游离探针;泳道2，探针+重组蛋白;泳道3-7，作为泳道2，具有渐增浓度的冷RNA。箭头表示游离探针，RNA-蛋白复合物用箭头表示
与未标记的RNA的竞争
在使用EMSA证实蛋白质与特异性RNA靶标的结合之后，可以通过在未标记的过量的相同RNA存在下的竞争研究来测试相互作用的特异性。向结合反应混合物中加入增加量的竞争剂RNA（高达100x的标记的RNA），并且如上使用天然凝胶电泳测定冷竞争剂RNA破坏复合物的能力（参见图2b）。未标记的竞争RNA以与上述相同的方式产生（参见A部分），除了冷UTP的量增加至5mM，并且放射性UTP的量减少至0.045μCi。

笔记

孵育3小时产生大量的RNA
对于〜100碱基长的RNA探针运行凝胶1小时;对于200至300nt长的探针，运行凝胶2至3小时
重要的是在变性凝胶上运行体外转录的RNA以确认产生正确大小的产物。然后应该切除和纯化正确的大小带。
有时RNA模板由于其二级结构而产生两种或更多种RNA产物。如果发生这种情况，只有正确的尺寸带进行纯化。
使用放射性标记的UTP的比活性，UTP的最终浓度（放射性标记的UTP加冷UTP）在反应中的浓度和模板中"U"残基的数目来计算RNA中标记的"U"的浓度。（RNA的摩尔数= RNA探针中UTP的f摩尔数/标记的RNA中"U"残基的数目）。
由于可溶性级分中的蛋白质量根据克隆和表达水平而变化，因此有必要优化琼脂糖珠粒和蛋白质之间的比例。
重组蛋白应纯化至接近均匀，并应测定蛋白浓度。不建议使用表达重组蛋白的细菌的粗提取物
始终使用已知浓度的RNA探针和增加蛋白质的浓度
硫酸肝素降低RNA探针与蛋白质的非特异性结合并消除背景
天然凝胶的运行时间取决于RNA和蛋白质复合物，必须针对每种RNA和蛋白质进行优化。对于更长的运行时间，凝胶必须在4°C的温度下运行。
较小尺寸的RNA探针（50至200个核苷酸）在RNA EMSA中工作良好
如果一些RNA /蛋白复合物停留在孔中，则加入BSA以使这种影响最小化
应针对每个RNA-蛋白复合物优化RNA和蛋白质的浓度。大约100,000 cpm的RNA和500 ng蛋白质是结合研究的良好起点

食谱

注意：所有缓冲液应使用不含RNase的水制备。

5x凝胶移位缓冲液
70 mM HEPES pH 7.9
450 mM KCl
11mM MgCl 2
28％甘油

裂解缓冲液
50 mM HEPES pH 7.9
150 mM KCl
1mM MgCl 2
1％Triton X-100 10％甘油

10x TBE
108克Tris碱
55克硼酸
9.3克溶于水中的EDTA 加至一升，高压灭菌
使用1x作为运行缓冲液运行变性和非变性（本地）凝胶

凝胶混合物（500ml） 240克尿素
50ml 10×TBE
200ml H 2 O 2 / 凝胶混合物在室温下稳定至少两至三个月

5％变性凝胶（30ml） 5ml 30％丙烯酰胺/双丙烯酰胺 25 ml凝胶混合物
300微升10％APS
30μlTEMED

5％无变性凝胶
6.75ml 40％丙烯酰胺/双丙烯酰胺（38:2） 4.5 ml的10x TBE
300μl10％APS
30μl的TEMED
33.6ml H 2 O 2 /

TNS解决方案
25mM Tris-HCl pH7.5 400 mM NaCl
0.1％SDS

尿素凝胶的RNA加载染料
20mM Tris-HCl pH7.6
8 M尿素
1mM EDTA
0.05％二甲苯蓝 0.05％溴酚蓝

用于非尿素凝胶的6x装载缓冲液
30％甘油
0.3％溴酚蓝
0.3％二甲苯基氰

装订/清洗缓冲区
20mM Tris-HCl，pH7.5 150mM NaCl 0.1％Triton X-100 1x蛋白酶抑制剂

磷酸盐缓冲液
10mM Na 2 HPO 4
2mM KH 2 PO 4 sub/
2.7 mM KCl
137 NaCl pH7.4

柠檬酸盐缓冲液
2 M柠檬酸
用10M KOH调节pH至2，稀释至0.2M

致谢

该协议改编自Thomas 等人（2012）。这项工作得到了美国国家科学基金会的资助。

参考文献

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