材料和试剂

百日咳博德特氏菌菌株BP536是临床分离株Tohama I菌株（实验室库存）的抗tet抗性衍生物
甲酸（> 95％）（Sigma-Aldrich，目录号：F0507）
NaOH（Thermo Fisher Scientific，目录号：SS255-1）
Tris碱（MP Biomedicals，目录号：819620）
溴酚蓝（Sigma-Aldrich，目录号：B8026）
甘油（Invitrogen，目录号：15514-011）
丁醇（Sigma-Aldrich，目录号：15467-9）
30％29:1丙烯酰胺/双丙烯酰胺（Sigma-Aldrich，目录号：A3574）
10％SDS（Hoefer，目录号：GR155-1）
Phos-tag TM TM丙烯酰胺（Wako Pure Chemical Industries，目录号：AAL-107）
Zn（NO 3）2（Sigma-Aldrich，目录号：228737）
过硫酸铵（Sigma-Aldrich，目录号：3678）
N，N，N'，N'-四甲基乙二胺（TEMED）（Sigma-Aldrich，目录号：T9281）
0.5M EDTA，pH8.0（Research Genetics，目录号：750009）
MOPS（Fluka，目录号：69947）
偏亚硫酸氢钠（Na 2 SS 2 O 5）（Sigma-Aldrich，目录号：S9000）
甘氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：G7126-1KG）
甲醇（EMD Millipore，目录号：MX0485-7）
PBS缓冲液（Gibco，目录号：2014-10）
Bacto ^TM蛋白胨（Becton，Dickinson and Company，目录号：211684）
Difco ^TM Bordet Gengou琼脂基料（Becton，Dickinson and Company，目录号：248200）
去纤维蛋白绵羊血（LAMPIRE ^{Biological Labs，目录号：7239001）}
乙酰磷酸锂钾（Sigma-Aldrich，目录号：A0262-500MG）
胶体蓝染色试剂盒（Life Technologies，目录号：LC6025）
Tween-20（Bio-Rad Laboratories，目录号：M3524）
脱脂奶粉（Giant Food Store，目录号：688267078330）
单克隆抗BvgA抗体（实验室库存）
HRP-偶联的二抗（Santa Cruz，目录号：SC2005）
Amersham ECL Primer Western Blotting Detection System（General Electric Company，目录号：RPN2232）
PVDF过滤器（Invitrogen，目录号：LC6025）
BSA（来自牛血清的白蛋白）（Sigma-Aldrich，目录号：A2153）
1 M甲酸（参见配方）
5 N NaOH（见配方）
1 M Tris-Cl溶液（参见配方）
1％溴酚蓝（见配方）
5x加载解决方案（参见配方）
水饱和的丁醇（见配方）
5mM Phos-tag ^TM丙烯酰胺（参见配方）
10mM Zn（NO 3）2（参见配方）
10％APS（参见配方）
1x MOPS运行缓冲液，pH 7.8（参见配方）
传输缓冲区（参见配方）
BG琼脂平板（见配方）
200 mM乙酰磷酸（见配方）
1％或5％BSA的PBS溶液（参见配方）
0.05％Tween-20的PBS溶液（参见配方）
1％PBS中的脱脂牛奶（参见配方）

设备

聚酯涂抹器（Puritan Medical，目录号：25-806 1PD）
分光光度计
微型凝胶盒（1.0mm）（Invitrogen，目录号：NC2010）
10，12或15-孔梳（1.0mm）（Invitrogen，目录号：NC3015）
XCell SureLock Mini-Cell（Invitrogen，目录号：EI0001）
平台振动器
Eppendorf微量离心器
Bio-Rad Mini-Protean II（Bio-Rad Laboratories）

程序

用于体内的全细胞裂解物制备检测BvgA磷酸化
注意：此协议已成功用于另一种革兰氏阴性菌E.coli。
1. 为了收集细菌样品，将在BG琼脂板上在37℃下生长2天的百日咳博德特氏菌菌株BP536用聚酯头涂布器从板上擦拭并重悬于1.5ml PBS中。 br />
2. 使用来自步骤A1的等分试样来测定OD <600>读数
3. 将来自步骤A1的0.3ml等分试样在15,600×g下在Eppendorf微量离心机中在室温下离心1分钟。除去上清液，将所得沉淀物在干冰中冷冻。它可以直接使用或储存在-80°C
4. 如下处理冷冻的沉淀。
  注意：体积基于0.5的OD <600>读数和从0.3ml获得的沉淀，应根据测定的OD 600来按比例调节体积。
  首先，加入33μl冰冷的1M甲酸，并通过重复吹打破碎沉淀。立即加入含有2μl5N NaOH（以中和酸），10μlH 2 O和15μl5x上样溶液的新鲜制备的冰冷溶液（27μl）。
  注意：溶液的颜色由于酸而变黄，但是溴酚蓝一旦进入凝胶就变回蓝色。
5. 将4μl所得细胞裂解物加载到用于电泳的Phos-tag ^TM凝胶上。
  注意：不要煮沸处理的细胞裂解物;裂解物应在装载前保存在冰上。

Phos-tag ^TM SDS-PAGE凝胶电泳（Recipe make one mini gel。）

4％堆积凝胶
30％丙烯酰胺/双丙烯酰胺	417.5微升
1M Tris pH 6.8	1,093微升
10％SDS	31.3微升
10％APS（新鲜制备）	25μl
TEMED	5微升
H sub 2 O	1,570μl

10％解决凝胶
30％丙烯酰胺/双丙烯酰胺	2,085μl
1M Tris pH 6.8	2,185微升
10％SDS	62.5微升
5mM Phos-tag ^TM	93.8μl
10mM Zn（NO 3）2 sub。	93.8μl
10％APS（新鲜制备）	25μl
TEMED	5微升
H sub 2 O	1,715微升

对于拆分凝胶：丙烯酰胺，Tris，SDS，Phos-tag TM，Zn（NO 3）2和H 2 SO 4，/sub> O混合。加入10％APS和TEMED，并将溶液立即倒入凝胶盒中。然后用1ml水饱和的丁醇覆盖溶液。拆分凝胶在室温下〜40分钟内聚合
从聚合的拆分凝胶中倒出丁醇，然后用水洗涤凝胶表面。用吸水纸除去多余的水。
对于堆叠胶：将丙烯酰胺，Tris，SDS和H 2 O混合。加入10％APS和TEMED，并将溶液立即倒入凝胶盒中。梳子迅速插入（避免引入气泡），并使堆叠的凝胶在室温下聚合20分钟
在将凝胶盒插入电泳装置后，加入冰冷的1x MOPS运行缓冲液。然后将整个设备放入充满冰的桶中，将桶放在平台振荡器上，使其可以轻轻旋转，直到室中运行缓冲液的温度冷却至4℃。这通常需要至少30分钟。
注意：在一个XCell SureLock ^® Mini-Cell中只放置一个凝胶盒，以确保电泳期间温度保持冷。
关闭振动器，使用移液管加载样品。
在温和振荡恢复后，以恒定的100V持续30分钟，120V持续30分钟，然后150V直到溴酚蓝染料距离凝胶底部〜1cm为止进行电泳。（内部凝胶室内的温度将升至10℃至15℃）
对于蛋白质印迹分析，用含有1mM EDTA的100ml转移缓冲液洗涤凝胶10分钟以从凝胶中除去Zn 2+，随后再次用100ml转移缓冲液洗涤20分钟。
将凝胶转移到PVDF过滤器中，该PVDF过滤器预先用甲醇然后用转移缓冲液在装有冰冷转移缓冲液的Bio-Rad Mini-Protean II装置中在100℃恒压下在4℃漂洗1小时。
BvgA的抗体检测在室温下如下进行：转移后，通过用PBS中的5％BSA洗涤1小时来封闭PVDF过滤器，然后与单克隆抗BvgA抗体（1:5000）一起温育1％BSA的PBS溶液1小时。在与HRP缀合的二抗（1:2000）在PBS中的1％脱脂奶中孵育1小时之前，用在PBS中的0.05％Tween-20进行三次10分钟洗涤。将PVDF过滤器洗涤三次，每次10分钟，用PBS中的0.05％Tween-20洗涤，然后根据制造商的说明用Amersham ECL Primer Western印迹检测系统显影。

体外分离磷酸化的纯化蛋白质
1. 为了体外磷酸化，将9μl纯化的BvgA（约1至25pmol）与1μl200mM乙酰磷酸在冰上混合，然后在37℃下温育所需的时间。 br />
2. 将样品置于干冰上停止反应。
3. 样品与2.5μl5x上样溶液（最终浓度为1x）混合，在Phostag TM丙烯酰胺凝胶上分离，洗涤并如上所述通过Western分析检测。
4. 或者，可以染色凝胶。在这种情况下，首先将凝胶在100ml水中洗涤3次，每次10分钟。然后根据制造商的说明书用胶体蓝处理凝胶注意：为了获得最佳效果，使用胶体蓝或经典考马斯蓝染色，而不是其他类型的蛋白质染色。
  注意：对于Western分析，加载的纯化蛋白的最佳水平为〜1pmol，对于凝胶染色为〜25pmol。
  
  图1.通过Western印迹分析的通过Phos-标记的SDS-PAGE分离磷酸化的BvgA与未磷酸化的BvgA。第一泳道显示在体内 B的溶胞产物。百日咳，其含有磷酸化的BvgA（BvgA〜P）和非磷酸化的BvgA（BvgA）。泳道2和3显示纯化的BvgA，其已经通过添加乙酰磷酸酯或在不存在乙酰磷酸酯下分别孵育而在体外被磷酸化。

食谱

1 M甲酸
在95ml H 2 O中的5ml甲酸（> 95％）
储存在4°C
5 N NaOH
5ml 10N NaOH
5毫升H 2 O 2 / 储存在4°C
1 M Tris-Cl溶液（1 L）
121.14g Tris碱，在4℃下用HCl调节至pH 6.8或pH 8.0 过滤灭菌
1％溴酚蓝
1g在100ml H 2 O中的溴酚蓝
5x加载解决方案
1％SDS
65mM Tris-Cl（pH6.8） 25％甘油 0.02％溴酚蓝
储存在4°C
水饱和的丁醇
将4ml水加入到40ml丁醇中摇动混合
丁醇将是顶层
5mM Phos-标记丙烯酰胺 10mg溶于100μl甲醇中的Phos-tag TM丙烯酰胺将溶液重复移液以溶解丙烯酰胺加入3.2ml H 2 O 2 / 将溶液在2,000×g离心10分钟以除去白色沉淀物
储存于4℃，黑暗
10mM Zn（NO 3）2 sub。溶解在1L H 2 O中的2.97g Zn（NO 3）2溶液
过滤灭菌
10％APS
1g溶解在10ml H 2 O中的过硫酸铵溶液是新鲜制备的
1x MOPS运行缓冲液，pH 7.8
100mM Tris-CL，pH7.8
100mM MOPS，pH 7.8 0.1％SDS
5mM偏亚硫酸氢钠对于1 L
12.1克Tris碱
20.9克MOPS
10ml 10％SDS
0.95克偏亚硫酸氢钠（Na 2 SS 2 O 5）
用10N HCl在4℃下将溶液调节至pH 7.8 储存在4°C
传输缓冲区
3克Tris碱
14.4g甘氨酸
200ml甲醇
800ml H 2 O 2 /
BG琼脂平板
10 g Difco ^TM Bordet Gengou琼脂基料
3.3g Bacto TM sup/TM蛋白胨
将3.3ml甘油加入到350ml H 2 O中将混合物高压灭菌
冷却至46℃，然后加入50ml脱纤维绵羊血液
将温热的溶液倒入陪替氏培养皿中，并允许冷却至室温。
储存在4°C
200mM乙酰磷酸 0.0039g乙酰磷酸锂钾溶于105.7μl20mM Tris-Cl，pH8中的溶液新鲜制备溶液存放在冰上
1％或5％BSA的PBS溶液
1 g或5 g BSA
100 ml PBS
0.05％Tween-20的PBS溶液中 0.05ml Tween-20 100ml的PBS
1％无脂牛奶的PBS溶液
1克脱脂奶粉
100ml的PBS

致谢

该协议基于先前发表的论文Boulanger等人（2013）。该研究得到了NIH NIDDK的院内研究计划的部分支持。

参考文献

Barbieri，C.M.and Stock，A.M。（2008）。使用基于Phos标记的体外和体内监测反应调节剂天冬氨酸磷酸化的通用方法试剂。 Anal Biochem 376（1）：73-82
Boulanger，A.，Chen，Q.，Hinton，DM和Stibitz，S。（2013）。体内磷酸化动力学百日咳博德特氏菌毒力控制反应调节剂BvgA。 Mol Microbiol 88（1）：156-172。
Kinoshita，E。和Kinoshita-Kikuta，E。（2011）。在中性pH条件下改进的Phos-tag SDS-PAGE，用于高级蛋白磷酸化分析。 Proteomics 11（2）：319-323