材料和试剂

花（-1至1 DPA的花容易操作）
0.1％（w/v）HgCl 2（警告：HgCl 2）是非常危险的，请根据实验室条件选择有利的试剂进行灭菌，否则75％乙醇和 N，N'-二环己基碳二亚胺（DCCS）可以是替代物）
甲苯胺蓝O（Sigma-Aldrich，目录号：T3260）
冰乙酸 - 乙醇 - 水（10:95:5，v/v）洗脱
维生素：
VB1（维生素B1，硫胺素）（Sigma-Aldrich，目录号：T3902） VB6（维生素B6，吡哆醇）（Sigma-Aldrich，目录号：P8666） VB3（维生素B3，烟酸）（Sigma-Aldrich，目录号：N0765）
肌醇（Sigma-Aldrich，目录号：I3011）
IAA（Sigma-Aldrich，目录号：I2886）
GA 3（Sigma-Aldrich，目录号：G7645）
（Sigma-Aldrich）
（Sigma-Aldrich公司）。
MgSO 4·7H 2 O（Sigma-Aldrich）
KNO 3（Sigma-Aldrich）
（Sigma-Aldrich）
（Sigma-Aldrich公司），其具有以下结构：其中R 1，R 2，R 3，R 4，R 5，R 6，
KI（Sigma-Aldrich）
（Sigma-Aldrich公司）。
（Sigma-Aldrich）
ZnSO 47H 2 O（Sigma-Aldrich）
（Sigma-Aldrich）制备的CuSO 4·6H 2 O（Sigma-Aldrich）
（Sigma-Aldrich）
Na 2 EDTA（Sigma-Aldrich）
BT介质准备（参见配方）
激素准备（见配方）
工作BT介质准备（参见配方）

设备

锥形烧瓶（50ml）
1.5 ml微量离心管
分光光度计（Beckman Coulter，型号：DU 800）或酶标仪（Tecan Trading AG，型号：infinite M200）
带燃烧器的洁净台层流风罩（哈尔滨东电子科技，型号：HD-1360）
普通植物组织培养设备（量筒/容量瓶，烧杯，称重机，高压灭菌器，pH计，手术刀，精钳）

软件

ImageJ

程序

卵巢灭菌
1. 花（图1）收集与植物1至3厘米的Anthocaulus（Anthocaulus的长度通常是1至3厘米在我们使用的棉花种类，如果一些其他的更长，你可以根据你的意愿削减;但较短的是不推荐选择，除非没有其他选择）。用手小心地彻底去除花瓣，雄蕊和苞片（或者你可以用一些特殊的辅助器具，但确保不伤害棉铃）。
  
  图1.棉花花卉
2. 如果雌蕊是活力的，例如来自开花期之前或之前的雌蕊，其中雌蕊与棉铃连接，而它们在开花后2天（DPA）后将是生理脱落的，则应当保持它们以避免液体渗入棉铃通过伤口灭菌时。
3. 将整个剩余的组织（与孔雀和/或雌蕊相连的棉铃）立即浸泡在0.1％（w/v）HgCl 2中15分钟（需要偶尔摇动/搅拌以保持所有组织完全浸泡），弃去HgCl 2并用灭菌的ddH 2 O 3冲洗三次。每次2至5分钟。
胚珠制备
1. 保持组织与Anthocaulus，并删除卵巢（或年轻棉铃）小心用无菌镊子，然后漂浮和分散完整的胚珠在液体BT培养基轻轻地。确保胚珠没有受伤，破碎或附着棕色棉酚从破碎的shuck。
2. 对于相同的批次培养，每个烧瓶中应该放入相等的胚珠，每个批次通常少于20个胚珠。
3. 如果胚珠培养超过10天，每个烧瓶中的胚珠总量应该在开始时小于10。
4. 对于没有生长纤维的幼小胚珠，它们可以容易地分离，而对于粘在一起的具有较长纤维的胚珠，例如开花后2天（DPA）中的胚珠，它们需要用镊子之前漂浮在介质上。
5. 给烧瓶标明日期，胚珠的年龄和所含的激素
胚珠培养
1. 将浮动胚珠在30℃无光照和温育。
2. 在0 DPA胚珠培养4-5天后，纤维应该是容易看到的（图2）。
  
  图2.培养5天后的DPA胚珠
3. 胚珠或纤维可用于进一步分析，例如纤维生产测量，RNA提取和生物化学分析等。。
光纤测量
有两种方法来测量纤维生产
1. 总光纤单元（TFU）测量，其也由Beasley等人（1974）创新。
  1. 对于12天培养的胚珠，每个测定10个胚珠。用滤纸从培养基中干燥胚芽。浸泡在沸水中2分钟，然后用滤纸再次干燥2至3分钟
  2. 在一个小烧杯中用20ml 0.02％甲苯胺蓝O染色胚珠30秒钟，然后用细筛筛除液体，在流水中洗1分钟，立即除去未吸收的染料。
  3. 干燥胚珠，然后用20ml冰醋酸 - 乙醇 - 水（10：95：5）在烧瓶中脱色2小时。烧瓶应密封以避免液体蒸发，这可能导致脱色液体浓度的差异。
  4. 测量脱色液在624nm处的吸光度，并计算为纤维的相对产率
2. 光纤长度测量（图3）
  1. 将胚珠在沸水中浸泡2分钟或在75％乙醇中浸泡15分钟，然后将胚珠置于缓慢流动的水中以使纤维流向一侧并用尺子测量。
  2. 或者将胚珠放在载玻片上，用解剖针轻轻梳理纤维，然后用尺子拍照并测量长度，或者可以使用软件进行测量的自动化（例如图像J）。
    
    图3.培养的胚珠（1）在75％乙醇（2）中浸泡至分离纤维并在载玻片（3）上测量

笔记

该方案可用于分析十几种化学物质的影响，包括激素，植物生长调节剂，植物生长抑制剂和类黄酮（Tan等人，2013）。，在我们实验室的纤维发展。我们发现它在陆地棉中同样地起作用（应用了超过4个品种），G。 arboreum 和 G.herbaceum 。但是对于巴巴多登（G.barbadense）来说，纤维生长速率和激素反应将存在一些差异。纤维将生长更晚和更少，并且GA <3>不能独立地促进0 DPA胚珠的纤维生长。
虽然它是一个非常敏感的系统，许多因素参与成功测定，特别是对于胚珠发育阶段。根据我们未发表的数据，对于响应于IAA和GA 3的从上午7点到12点的0DPA胚珠存在显着差异。和GA 3可以促进纤维生长独立于0 DPA胚珠上午12时，除了来自G。 barbadense 。在DPA之前的胚珠可能不容易漂浮在液体介质上，应该更温和地采取。不同发育阶段的胚珠也对化学处理有不同的响应（Tan等人，2012）。因此对于相同的测定，胚珠应当来自相同的阶段，并且所有的操作应该严格一致，并且应该为每个设置控制。来自不同批次的样品不能一起分析
应该分别制备并与KH 2 PO 4反应来储存CaCl 2 2+ 2H 2 O 2。在使用前仔细混合并稀释。
其它化学品应首先灭菌并加入具有IAA和/或GA 3的培养基中。每种新化学药品都应进行剂量测试以确定最佳剂量
来自温室的胚珠的感染率小于来自田间的胚珠的感染率。
开始之前先做一个简单的计划。从卵巢释放胚珠需要很多时间（对于新生，每小时大约10个胚珠）。
对于TFU测定，通常每个测定为10个胚珠，而其应根据培养日期和胚珠体积而改变。

食谱

BT培养基制备

制备20x微量元素储液（储存在4℃）
化学品（公司）	mol.wt	最终浓度。（mg/L）	最终浓度。（mM）	浓缩。股票（mM）	mg服用	库存最终数量
KH ₂ PO ₄	136.09	272.18	2	40	5,443.6	1000 ml
CaCl 2 ^。 2H O	147.01	441.06	3	60	8,821.2
MgSO 4。。 O	246.47	493.00	2	40	9865
KNO ₃	101.10	5,055.50	50	1,000	101,110
制备100x微量元素储液（储存在4℃）
H ₃ BO ₃	61.83	6.183	0.1	10	618.3	1000 ml
	241.95	0.242	0.001	0.1	24.2
KI	166	0.830	0.005	0.5	83
CoCl <2> ^。 6H <2> O	237.93	0.024	0.0001	0.01	2.4
MnSO 4 ^。 H O	169.02	16.902	0.1	10	1,690.2
ZnSO 4 。 7H O	287.56	8.627	0.03	3	862.7
CuSO 4 ^。 5H ₂ O	249.69	0.025	0.0001	0.01	2.5
100×Fe盐储备溶液的制备（储存在棕色瓶中，4℃）
FeSO 4 ^。 7H <2> O	278.01	8.341	0.03	3	834.1	1000 ml
Na 2 EDTA	372.24	11.167	0.03	3	1,116.7	1000 ml
1,000x维生素混合物储备液的制备（储存在4℃）
VB1	337.27	1.349	0.004	4	1,349	1000 ml
VB6	205.64	0.822	0.004	4	822
VB3	123.11	0.492	0.004	4	492
制备100x肌醇储备液（储存在4℃）
肌醇	180.16	180.160	1	100		1000 ml

激素准备
棉花胚珠培养物的一般激素是IAA和GA 3。IAA和GA 3的储备溶液分别为5mM和0.5mM。两者都是1,000x的溶液，预先溶解在小体积（500-1,000μl）的95％乙醇中，然后用无菌的双蒸水H 2 O水补足体积，分成1.5ml 微量离心管，密封并储存于-20°C。通常每次制备10至50毫升储备溶液

工作BT介质制备

库存	浓缩。的股票	取得的股票金额	最终卷 of media
宏元素混合物	20x	50 ml	1000 ml
微元素混合物	100x	10 ml
Fe盐溶液	100x	10 ml
维生素混合物	1,000x	1 ml
肌醇	100x	10 ml
葡萄糖		24克
pH 5.0

在使用前，在100,200ml或其它一定体积中制备培养基，灭菌后，加入合适的激素，混合并等分到灭菌的50ml烧瓶中，每个约10ml。标记烧瓶中含有什么类型的激素，准备和有效期（培养基应在不到15天内使用）。

致谢

该协议基于Beasley和Ting的原始工作（Beasley和Ting，1973），并且根据我们先前发表的两篇文章（Tan等人，2012; Tan等人， 2013）。这项工作得到了大学科技自主创新基金会，中国国家自然科学基金（拨款号30871560和31230056）和中国国家高技术计划（拨款号2012AA101108）的支持。

参考文献

Beasley，C。和Ting，I.P。（1973）。植物生长物质对来自受精棉胚珠的体外纤维发育的影响。 a> 130-139。
Beasley，C.A.，Birnbaum，E.H.，Dugger，W.M.and Ting，I.P。（1974）。估算棉纤维生长的定量程序染色技术 49（2）：85-92。
Tan，J.，Tu，L.，Deng，F.，Hu，H.，Nie，Y.and Zhang，遗传和代谢分析显示，棉花纤维细胞发育被类黄酮柚皮素阻滞。 162（1）：86-95。
Tan，J.，Tu，L.，Deng，F.，Wu，R。和Zhang，X。（2012）。外源茉莉酮酸抑制棉花纤维伸长。植物生长调节 31（4）：599-605。