材料和试剂

志贺氏菌菌株
胰蛋白酶大豆肉汤（TSB）（VWR国际，目录号：欧洲1.00525.5000和美国EM1.00525.5007）
琼脂（MP Biomedicals，目录号：0210026291）
刚果红（VWR国际，目录号：欧洲34140.184）
抗IpaD和-IpaB多克隆抗体（自制）
PBS（Fischer Scientific，目录号：BP399-20）
多聚甲醛（PFA）（Sigma-Aldrich，目录号：P6148）
Triton X-100（VWR International，欧洲目录号：1.08603.1000）
Trizmabase（Sigma-Aldrich，目录号：T1503）
牛血清白蛋白（BSA）（VWR International，目录号：422361V）
抗小鼠第二抗体CF647缀合（Sigma-Aldrich，目录号：SAB4600351）
PBS + PFA 4％储备液（见配方）
刚果红琼脂板（见配方）

设备

250 ml Erlenmeyer
微管
CR琼脂平板
用于FACS分析的聚苯乙烯管
离心加热磁力搅拌器
37℃摇床
旋转搅拌器
使用四色FACS Calibur细胞计数器（Becton Dickinson and Company）的流式细胞术

程序

细菌样品的制备
1. 在刚果红（CR）阳性的志贺氏菌菌落在CR琼脂平板上的TSB（37℃，摇动）中进行夜间预培养。
2. 在新鲜TSB中稀释1：100预培养物（体积参见步骤A3），并在37℃下振荡温育直至达到OD 600 = 1.5。（培养基必须过滤或高压灭菌，搅拌以避免葡萄糖焦糖化，干扰III型分泌）。
3. 在室温（RT）下，在2,000×g下每个测试条件收获2×10 8个细菌4分钟（OD 600 = 1）对应于大约5×10 8个细菌）
4. 用500μl含有0.1％Triton X-100的冰冷PBS洗涤两次（如步骤A3中的离心条件）。当取出液体上清液时要小心，因为颗粒可以沿着整个过程逐渐脱离
5. 重悬在500μl冰冷的PBS与0.1％Triton X-100和添加500微升PBS + PFA（4％）以修复细菌。
6. 通过倒置混合并在室温下孵育20分钟
7. 加入50μlTris HCl 1M（pH 7.5），倒置混合，在室温下孵育5分钟以淬灭交联剂。
8. 在RT下收获细菌（10,000×g）2分钟（用这些参数进行所有进一步的离心步骤）。
9. 用1ml PBS + 0.1％Triton X-100洗涤一次，用1ml PBS洗涤一次
免疫染色
1. 收获细菌，并在500μl封闭溶液（PBS + 4％BSA）中重悬
2. 在旋转混合器上在4℃下孵育细菌1小时
3. 收获细菌，并重悬在250μlPBS + 4％BSA中，用1:100稀释的小鼠血清血清来自用GST-1paD 131-332（Schiavolin等人，2013）或His-IpgC + IpaB免疫的Swiss小鼠（Pageem et al。/em，1999）。 IpaD和IpaB定位的阴性对照分别是缺乏其不结合针尖的最后残基的IpaD蛋白（Espina等人，2006）和ipaD KO突变体其中IpaB不保留在尖端（Veenendaal等人，2007）。在这两种情况下，分泌的IpaD或IpaB不干扰测定
4. 在4℃下搅拌孵育过夜。
5. 加入750微升PBS的细菌，然后用1毫升PBS洗涤两次。所有进一步的步骤在黑暗中进行以保持二抗的荧光性质。微管或架子用铝箔覆盖。
6. 重悬于250μlPBS + 4％BSA中，用1:500稀释的山羊CF647缀合的抗小鼠IgG抗体。
7. 在4℃下搅拌1小时或更长时间（孵育时间可能持续过夜）。
8. 向细菌中加入750μlPBS，然后用1ml PBS洗涤两次
9. 将细菌沉淀重悬在500μlPBS中，并在FACS聚苯乙烯管中1:10稀释
10. 例如，用四色FACS Calibur细胞计数器通过流式细胞术分析（在第三参考文献（Schiavolin等人，2013）的支持信息中可以找到结果的实例，可以在 > Mol.Microbiol。网站）。
11. 使用的参数（无补偿）：
  
  探测器
  电压
  模式
  
  FSC
  E02
  记录
  
  RSS
  366
  记录
  
  FL4
  800
  记录

食谱

PBS + PFA 4％储备溶液（100ml）
称重4g多聚甲醛在250ml锥形瓶中加入80ml双蒸水
加入50μl的1M NaOH
添加磁条并关闭erlenmeyer
在70℃加热直至完全溶解（溶液应变清澈）
放在冰上，让溶液冷却至室温
用双蒸水
调节体积至90 ml 加入10 ml PBS 10x，并混合
用0.2μm25mm尼龙注射器过滤器过滤溶液，并在15ml falcon管中等分新鲜制备的PFA可以储存在-20℃用于进一步测定（在RT轻轻解冻）
刚果红琼脂平板
用双蒸水制备30g/L TSB溶液，并溶解15g/L琼脂
将培养基在120°C高压灭菌15分钟（如果您将培养基高压灭菌20分钟，糖会焦糖化，你的培养皿会变得更暗，甚至在37°C的细菌孵化后变得最暗）。
添加刚果红，最终浓度为250μg/ml（当用保护性手套安全处理瓶子时，制备浓度为10mg/ml的双重蒸馏水中的储备溶液）。

致谢

该协议改编自Lee等人（2010）。本研究得到了比利时全国农业研究金（FRS-FNRS;公约3.4556.11）和欧洲共同体第七框架计划FP7/2011-2015（赠款协议第261742号）的资助。和A.M是来自比利时国家工业和农业（FRIA）的博士研究生的接受者。这项工作的一部分也得到Fonds Defay，Van Buuren和Héger-Masson基金会的支持。我们感谢A. Op de Beeck在执行FACS实验中的帮助。

参考文献

Espina，M.，Olive，A.J.，Kenjale，R.，Moore，D.S.，Ausar，S.F.，Kaminski，R.W.，Oaks，E.V.，Middaugh，C.R.，Picking，W.D.and Picking，W.L。（2006）。 IpaD本地化到志贺氏菌的III型分泌系统针的尖端。 74（8）：4391-4400。
Lee，P.C.，Stopford，C.M.，Svenson，A.G.and Rietsch，A。（2010）。通过绿脓杆菌类型III控制效应物输出分泌蛋白PcrG和PcrV。 Mol Microbiol 75（4）：924-941。
Page，A.L.，Ohayon，H.，Sansonetti，P.J.and Parsot，C。（1999）。分泌的IpaB和IpaC侵袭素及其胞质伴侣IpgC是细胞间传播志贺氏菌所需的。 1
Schiavolin，L.，Meghraoui，A.，Cherradi，Y.，Biskri，L.，Botteaux，A.和Allaoui，A。（2013）。对分泌控制中的志贺氏菌 III型针尖IpaD的功能洞察细胞接触。 Mol Microbiol 88（2）：268-282
Veenendaal，A.K.，Hodgkinson，J.L.，Schwarzer，L.，Stabat，D.，Zenk，S.F.and Blocker，A.J。（2007）。 III型分泌系统针尖复合物介导宿主细胞感测和translocon插入。 em> Mol Microbiol 63（6）：1719-1730。