材料和试剂

C57BL/6小鼠
70％酒精或异丙醇
PBS（Life Technologies，目录号：10010023）
EDTA（Life Technologies，目录号：15575-020）
RPMI 1640（Cellgro ，目录号：10-041-CV）
10％热灭活的FBS（内毒素<0.06EU/ml）（Hyclone，目录号：SH30071.03HI）
青霉素 - 链霉素 - 谷氨酰胺（Life Technologies，目录号：10378016）
非必需氨基酸（Life Technologies，目录号：11140050）
丙酮酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：S8636）
Hepes（适用于细胞培养）（Sigma-Aldrich，目录号：H0887）
2-巯基乙醇（EMD Millipore，目录号：ES-007-E）
硫代乙醇酸盐培养基（BD Biosciences，目录号：211716）
无热原水（Hyclone，目录号：SH30529.03）
cRPMI介质（参见配方）

设备

5毫升注射器
12孔板
15 ml无菌Falcon管
针（20 G和25 G）
离心机
37℃，5％CO 2细胞培养箱中培养
带有铝箔盖的300ml烧瓶
实验室炉

程序

驻留腹膜细胞的收获和培养
1. 填充5毫升PBS与5毫米EDTA的5毫升注射器与25 G针。
2. 麻醉和牺牲鼠标与CO ₂
3. 将鼠标放在腹部的纸巾上
4. 用70％酒精或异丙醇擦拭腹部。
5. 在覆盖腹膜壁的皮肤中心做一个小切口。
  注意：在皮肤上做小切口以剥离皮肤。注射和提取可以在腹膜的不同部位。
6. 牢牢拉皮肤露出腹膜壁。
7. 将针插入腹膜;避免将针插入内胆或膀胱。注射5ml PBS EDTA腹膜腔。
8. 按摩腹部约10-15秒。
9. 缓慢抽出针头。将注射器上的25 G针更换为20 G针
10. 用一只手将液体推到腹膜的一侧。使用另一只手，用大量流体将针插入腔的侧面，并从腹膜中抽出流体。避免脂肪，肠道或肠系膜，这可能会堵塞针头。尽量画出尽可能多的流体。通常，从一只老鼠可以回收约4 - 4.5毫升的液体
11. 从注射器中取出针头，并将内容物分装到冰上的离心管中
12. 离心腹膜细胞（300×g; 3分钟）并收集细胞沉淀。通常使用这种方法可从一只C57BL/6小鼠中回收约2-4百万个驻留的腹膜细胞，约50％是腹膜巨噬细胞。
13. 从1只小鼠的1ml cRPMI培养基中重悬细胞沉淀，计数细胞
14. 在12孔板中培养腹膜细胞，在37℃，5％CO 2下，在2ml /孔的1ml cRPMI中培养6-18小时。在此期间，腹膜巨噬细胞粘附在塑料表面。然后通过加入和抽吸0.5ml cRPMI培养基两次来冲洗漂浮的非巨噬细胞
15. 粘附的巨噬细胞可以使用。
收获和培养巯基乙酸盐诱发的腹膜细胞
可以按照如步骤1-15所述的相同方法，收获硫代乙醇酸盐诱导的腹膜巨噬细胞并培养，如下所示。
1. 制备3％巯基乙酸盐培养基。
  1. 在实验室烘箱中用带有铝箔盖（180-200℃）的300ml烧瓶加热至少18小时以除去内毒素。
  2. 将6克巯基乙酸盐培养基悬浮在200ml无热原水中
  3. 高压灭菌（15 psi/121°C/15 min）。
  4. 冷却后，等分至15ml无菌Falcon管。在使用前在室温下避光保存2个月。我们已经发现，在室温下储存2年的巯基乙酸盐培养基仍然可以使用
2. 注射1ml老化的巯基乙酸盐i.p. 每只小鼠。等待4-5天，收获腹膜细胞。从一只老鼠可以回收约10万个巨噬细胞
注意：根据IACUC批准的方案（LCID 11E）进行研究。

食谱

cRPMI培养基
具有10％热灭活的FBS（内毒素<0.06EU/ml）的RPMI 1640 2mM L-谷氨酰胺 100μM非必需氨基酸
100 U/ml青霉素
0.1mg/ml链霉素 10μM丙酮酸钠 25mM Hepes，pH7.4 50μM2-巯基乙醇

致谢

这项研究由NIH，NIAID的Intramural研究计划支持

参考文献

Lu，M.，Varley，A.W.and Munford，R.S.（2013）。持续活性微生物分子在体内延长先天性免疫耐受性。 PLoS Pathog 9（5）：e1003339。