材料和试剂

六至七周龄的小鼠（CD-1小鼠，Crl：CD1（ICR））（Charles River Laboratories）
Evans Blue Dye（Sigma-Aldrich，目录号：E2129）
氯胺酮（Sigma-Aldich，目录号：K2753）
甲苯噻嗪（Sigma-Aldich，目录号：X1251）
TNF-α（BD CBA flex set）（BD Biosciences，目录号：558273）
10％福尔马林（Sigma-Aldich，目录号：HT501128）
甲酰胺（Sigma-Aldich，目录号：F8775）
NaCl
KCl
Na HPO ₄
KH ₂ PO ₄
HCl
1x PBS（请参阅配方）
1％（w/v）Evans蓝染料在PBS中的溶液（参见配方）

设备

EDTA试管
冻干机
离心机（Beckman Coulter，型号：Allegra X-12R）（Rotor SX4750）
分光光度法（BioTek Instruments，型号：ELx808 Absorbance Microplate Reader）

程序

在最小量的每组4只小鼠中，将6-7周龄和18-20g重量的小鼠腹膜内注射2次剂量（每次100μl，相隔24小时）待评估的培养基或上清液。
由于TNF-α已被描述为血浆渗漏感应器，该细胞因子可用于注射作为阳性对照（4ng/ml）。
与第二剂量的条件上清液一起，小鼠腹膜内注射4ml/kg重量的1％伊文思蓝染料溶液（w/v，在PBS中），如前所述允许循环24小时（Manaenko等人，2011）。
在收集样品之前，向小鼠注射麻醉剂：氯胺酮（70mg/kg）和甲苯噻嗪（6mg/kg），之后通过心脏穿刺收集血液样品。
将血液立即置于EDTA管中。
样品在PBS中以1:2v/v稀释，并通过在3,000rpm下离心8分钟分离血浆
通过分光光度法在630nm测量血浆中存在的伊文思蓝染料的量。通过与标准曲线比较进行定量。
使用1×PBS中的Evans蓝染料在3至400ng/ml（R = 0.999）范围内的稀释液构建标准曲线。
为了评价肺毛细血管渗漏，用50ml PBS随后用20ml 10％福尔马林经心脏灌注小鼠用于组织固定。取出肺组织并保存在福尔马林溶液中在4℃直至分析。
将右肺真空干燥，称重，并在液氮中立即冷冻。
通过在65℃下与甲酰胺（2ml/g组织）温育过夜（Peng等人，2004）从肺中提取伊文思蓝染料。
通过离心（12,000xg，30分钟）使肺组织沉淀，并且在630nm下相对于标准曲线通过分光光度法测定在上清液中提取的伊文思蓝染料的浓度。以ng/ml肺组织测定伊文思蓝染料的浓度。然而，本研究设计用于比较不同细胞上清液的渗透诱导能力，因此，结果表示为相对于模拟或对照条件的倍数增加。然而，结果也可以直接表示为ng/ml组织。在对照和实验条件之间的任何统计学上显着的增加被认为是泄漏诱导（图1）

注意：这种类型的研究必须根据每个国家的标准生产，护理和使用实验动物的官方指南进行。

图1.经调节的上清液对体内血管通透性的影响。 6周至8周龄的小鼠（CD1株）用调节的上清液腹膜内注射两次，间隔24小时。 A.将1％伊文思蓝染料（EVD）的溶液与第二剂一起注射。 24小时后，从血浆和肺中提取EVD，并根据标准曲线定量。值表示为每个血浆的ng/ml（图A）或每个肺相对于对照的增加倍数（图B）。图C和D，分别是从血浆和肺提取的EVD的标准曲线。每个条件包括四只小鼠。统计学显着性为* p <0.05和** p <0.001。模拟：从模拟感染细胞收集的上清液。 DENV：从直接感染登革热病毒的细胞收集上清液。 DENV + Enh：从存在增强抗体的情况下感染的细胞收集上清液。 DENV + Mut：从存在突变抗体（不能诱导增强）的情况下感染的细胞中收集上清液。 DENV + Neu：从存在中和抗体的情况下感染的细胞收集上清液。 TNF-α：TNF-α用作阳性对照。

食谱

1x PBS
8g（137mM）NaCl 0.2克（2.7mM）KCl 1.44g（10mM）Na 2 HPO 4
0.24g（2mM）KH 2 PO 4>/
加入800ml H 2 O 2 / 用HCl
调节pH至7.4 加水最多1 L
1％（w/v）Evans蓝染料溶液在PBS中将1克伊文思蓝染料加到100毫升1×PBS中

致谢

该协议改编自Puerta-Guardo等人（2013）。该研究部分得到了墨西哥理工学院（CONACYT）给JEL和RMDA的拨款103783和127447的支持。 HPG和ARS是CONACYT奖学金的接受者。作者声明不存在利益冲突。

参考文献

Manaenko，A.，Chen，H.，Zhang，J.H.and Tang，J.（2011）。脑内出血的不同临床前模型的比较。 Acta Neurochir Suppl < em> 111：9-14。
Peng，X.，Hassoun，P.M.，Sammani，S.，McVerry，B.J.，Burne，M.J.，Rabb，H.，Pearse，D.，Tuder，R.M.and Garcia，J.G。（2004）。鞘氨醇1-磷酸在鼠内毒素诱导的炎性肺损伤中的保护作用 < em> Am J Respir Crit Care Med 169（11）：1245-1251。
Puerta-Guardo，H.，Raya-Sandino，A.，Gonzalez-Mariscal，L.，Rosales，VH，Ayala-Davila，J.，Chavez-Mungia，B.，Martinez-Fong，D.，Medina，，Ludert，JE和del Angel，RM（2013）。通过抗体依赖性增强登革热病毒感染的U937衍生的巨噬细胞的细胞因子应答破坏细胞顶端 - 结合复合物并增加血管通透性。
87（13）：7486-7501。