材料和试剂

水稻（<稻>水稻 L.）谷粒种子
甘露醇（Sigma-Aldrich）
吗啉代乙烷磺酸（MES）（Sigma-Aldrich）
纤维素R-10（Yakult Honsha）
Macerozyme R-10（Yakult Honsha）
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich）
羧苄青霉素/氨苄青霉素（AMRESCO）
β-巯基乙醇（β-ME）（Amresco）
聚乙二醇（PEG）4000（Sigma-Aldrich）
酶溶液（见配方）
PEG4000溶液（参见配方）
W5解决方案（参见配方）
MMG解决方案（参见配方）

设备

Shaker P270（中国科学院武汉科学仪器厂）
胶原包被的35毫米直径的玻璃底皿
Vortex XW-80A（JiaPeng Techno）
尼龙网（35μm）（EMD Millipore）
真空泵
50ml用圆底离心管
2ml离心管
台式离心机（Eppendorf 5810R和5417R）
胶原包被的35mm直径的玻璃基皿（Asahi Techno Glass Corporation）
共聚焦显微镜（Olympus，型号：FV1000）
OLYMPUS FV1000系统（Fluoview Ver.1.7b Viewer）（Olympus）

程序

原生质体制备
1. 在28℃的黑暗条件下，在湿纱布上发芽100粒灭菌米粒种子约1周。
2. 当培养的幼苗生长至约7〜8cm时，收集培养的幼苗，并立即使用锋利的刀片将幼苗切成约0.5mm的节段，然后将节段完全浸入50ml 0.6M甘露醇溶液中10分钟。
3. 将幼苗片段转移到酶溶液中。
4. 使用真空泵除去组织中的空气，帮助它们在酶溶液中完全沉淀。
5. 保持组织浸没的解决方案在黑暗中28°C，并在振荡器上以80 rpm搅拌约4小时。
6. 用ddH 2 O洗涤尼龙网（35μm），然后用W5溶液湿润3-5分钟，然后过滤原生质体，然后将酶消化的样品过滤到50ml离心管与圆底。稍微扭曲尼龙网，提高产量。
7. 在100×g离心5分钟，弃去上清液并用移液管尽可能多地除去残余液体，然后加入10ml预冷却的W5溶液，通过温和涡旋重新悬浮原生质体沉淀。
8. 在冰上孵育管子30分钟（以下操作在室温下）。
9. 通过离心（100×g离心5分钟）沉淀原生质体。弃去上清液并去除残余液体，然后轻轻加入1ml MMG溶液以重悬原生质体。最后，在显微镜下（40x）将原生质体密度调节至2×10 5个细胞/ml。
原生质体转化
注意：在原生质体转化之前，请根据Walter等人的方案制备BIFC表达载体。（2004），我们建议参考关于如何使用经济的CsCl梯度在Sheen实验室网站上制备质粒DNA的信息（
http://genetics.mgh.harvard.edu/sheenweb/protocols.html ）。
1. 将100μl原生质体分装到2ml离心管中
2. 为了转化，空载体pUC-SPYNE/pUC-SPYCE和bZIP6-YFPN/bZIP6-YFPC分别用作阴性和阳性对照。 20μl的BIFC载体（≥1-2μg/μl，每个载体10μl），阴性对照和阳性对照分别加入每个管中，然后轻轻混合。
3. 每管加入等体积（120μl）PEG溶液，混匀
4. 孵育混合物15分钟以进行转化
5. 加入480μlW5溶液以终止转化。
6. 将溶液以100×g离心2分钟，弃去上清液。
7. 加入1毫升W5溶液轻轻地重悬原生质体沉淀，加入1微升羧苄青霉素（50毫克/毫升），然后将原生质体转移到培养板，在室温下在黑暗中培养16-20小时，以允许BIFC蛋白的表达。
8. 在共聚焦观察之前，转化的原生质体应该在100×g离心2分钟并除去大部分上清液，然后重悬原生质体。

共聚焦观察

将原生质体转移到胶原包被的35毫米直径的玻璃基皿中进行显微镜观察
在Olympus FV1000系统上进行共焦荧光信号的收集
实验中自体荧光问题的干扰可以通过在共聚焦显微镜中产生的光学切片消除。我们选择使用488-nm线的氩激光器和505〜530nm带通发射滤光器的激发。
在该观察方案下，阳性对照显示强黄色荧光，阴性对照是黑色。这确认了上述所有操作对于BIFC观察是可靠的

食谱

酶溶液（10ml）

甘露醇（0.6 M）	1.093克
MES（10mM，pH 5.7）	1ml（100mM储备液）
纤维素R-10（1.5％）	0.15 g
Macerozyme R-10（0.75％）	0.075克
BSA（0.1％）	0.01 g
CaCl 2（1mM）	0.1ml（100mM储备液）
Carbenicilli（0.25g/ml）	2微升
β-ME	4微升

将ddH <2> O加到10ml ml/h 55℃10分钟
自然冷却（使用时准备）

PEG4000溶液

甘露醇（0.6 M）
1.093克

CaCl 2（100mM）
0.111克

PEG4000（40％）
4克

将ddH <2> O加到10ml ml/h 使用1M KOH将pH调节至7.5〜8.0 用1.5ml离心管等分，并保存在-20°C

W5溶液

W5（100ml）
154 mM NaCl	NaCl	0.9克
125mM CaCl 2。	CaCl <2>	1.39克
5 mM KCl	KCl	5ml 100mM储备液
5mM葡萄糖	葡萄糖	0.09克
2 mM MES	MES	2 ml 100 mM储备液
用KOH调节pH至5.8，高温高压灭菌20分钟，室温保存

MMG解决方案

MMG溶液（10ml）
15mM MgCl 2·h/v	MgCl 2	1.5 ml 100 mM储备液
4 mM MES	MES	0.4ml 100mM储备溶液
0.6 M甘露醇	甘露醇	1.093克
用KOH调节pH至5.8，高温高压灭菌20分钟，室温保存

致谢

该协议改编自Wymer等人（1999）; Walter等人（2004）; Yoo （2007）和Whang（2009）。

参考文献

Wymer，C.L.，Beven，A.F.，Boudonck，K.and Lloyd，C.W。（1999）。植物细胞的共焦显微镜检查方法Mol Biol 122 ：103-130。

Whang，S.S。（2009）。拟南芥胚胎发生的共聚焦显微镜研究使用GFP：mTn。植物生物学 52（4）：312-318。

Walter，M.，Chaban，C.，Schutze，K.，Batistic，O.，Weckermann，K.，Nake，C.，Blazevic，D.，Grefen，C.，Schumacher，K.，Oecking， Harter，K。和Kudla，J。（2004）。使用双分子荧光互补技术观察活植物细胞中蛋白质相互作用。植物J 40（3）：428-438。

Yoo，S.D.，Cho，Y.H。和Sheen，J。（2007）。拟南芥叶肉原生质体：用于瞬时基因表达分析的多功能细胞系统。 Nat Protoc 2（7）：1565-1572。