材料和试剂

粘附侵入性大肠杆菌参考菌株LF82（Darfeuille-Michaud等人，1998）
肠407（I-407）细胞（ATCC，目录号：CCL-6）
Luria Broth（BD Difco ^TM，目录号：244620）
葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：G8270）
M63培养基（United States Biological，目录号：M1015）
MgSO 4（Sigma-Aldrich，目录号：208094）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Mediatech，Cellgro ，目录号：21-040）
结晶紫（Sigma-Aldrich，目录号：C6158）
200 proof绝对乙醇（Sigma-Aldrich）
胎牛血清（FBS）（Mediatech，Cellgro ，目录号：35-010-CV）
非必需氨基酸（Mediatech，Cellgro ，目录号：25-025-CI）
L-谷氨酰胺（Mediatech，Cellgro ，目录号：25-005）
青霉素/链霉素/两性霉素B溶液（Mediatech，Cellgro ，目录号：30-004-CI）
维生素混合物（Mediatech，Cellgro ，目录号：25-020-CI）
甲醛溶液（Sigma-Aldrich，目录号：F8775）
鬼笔环胺 - 四甲基若丹明异氰酸酯（Sigma-Aldrich，目录号：P1951）
多聚甲醛
Hoechst 33258（Sigma-Aldrich，目录号：B1155）
Vectashield（Vector Labs，目录号：H-1000）
最低必需培养基（MEM）（Mediatech，Cellgro ，目录号：10-022-CV）（参见配方）

设备

盖玻片（电子显微镜科学）
无菌管
24孔组织培养板
非细胞处理的聚苯乙烯96孔微量滴定板（Falcon ，目录号：62406-117）
24孔聚苯乙烯板，组织培养处理（Falcon ，目录号：62406-159）
微量培养板振荡器（LABREPCO，型号：BT1500）
微孔板分光光度计
共焦显微镜
30℃培养箱
37℃/5％CO 2培养箱

软件

计算机程序COMSTAT1

程序

在非细胞处理的聚苯乙烯微量滴定板上的生物膜形成测定
1. 细菌菌株在无搅拌下在含有2ml含有5gL -1 -1葡萄糖的Luria-Bertani肉汤的无菌管中在35.5℃下生长过夜（Martinez-Medina等人， 2009; Chassaing和Darfeuille-Michaud，2013）。
2. 第二天，将细菌悬浮液在补充有1mM MgSO 4和8gL -1葡萄糖的M63基本培养基中稀释1/100。
3. 然后将130μl的等分试样置于非细胞处理的聚苯乙烯96孔微量滴定板的孔中，并在30℃下不摇动孵育24小时。一个设计为空白的设计仅接受补充有1mM MgSO 4和8gL -1葡萄糖而不含细菌的M63基本培养基。
4. 孵育后，使用微孔板振荡器将微孔板搅拌5分钟，然后使用微孔板分光光度计通过OD 620nm读数估计细菌生长。
5. 通过倾析除去液体，用200μl无菌PBS洗涤孔一次，无搅拌
6. 为了干燥它们，将板在室温下保持打开至少20分钟
7. 附着的细菌形成生物膜用130μl在乙醇中溶解的1％结晶紫在室温下搅拌5分钟染色。
8. 然后用200μl无菌PBS洗涤孔5次，无搅拌
9. 为了干燥它们，将板在室温下放置至少1小时
10. 加入130μl无水乙醇，将板在室温下不搅拌孵育5分钟
11. 使用微板振荡器进行10分钟（1000rpm）的高速搅拌
12. 使用微量培养板分光光度计通过OD 570nm读数估计生物膜形成。
  可以通过使用允许根据M63基本培养基中细菌生长的生物膜形成的标准化的比例OD 570nm/OD 620nm确定比生物膜形成指数。根据以前的出版物，野生型AIEC菌株LF82的特异性生物膜形成指数应该在2和4之间（Martinez-Medina等人，2009; Chassaing和Darfeuille-Michaud，2013） >
在多聚甲醛固定的I-407 IEC单层上的生物膜形成测定
肠407（I-407）细胞衍生自人肠道胚胎空肠和回肠组织。将它们在补充有10％（体积/体积）胎牛血清的最低必需培养基中在37℃下保持在含有5％CO 2的气氛中; 1％的非必需氨基酸; 1％的L-谷氨酰胺; 1％的青霉素/链霉素/两性霉素B溶液和1％的维生素混合物
1. 将单层以4×10 5个细胞/孔接种在24孔组织培养板中的盖玻片上，并在37℃下用5％CO 2孵育20小时。 br />
2. 然后将单层用1ml PBS洗涤一次，在室温下搅拌下在4％甲醛（稀释于无菌PBS中的储备溶液）中固定15分钟，然后用PBS洗涤4次。
3. 表达绿色荧光蛋白（GFP）的细菌菌株（Valdivia et al。，1996）如前所述从步骤A1至A2制备，在补充有1mM 的MgSO 4和8g.L -1葡萄糖。
4. 将1ml该细菌悬浮液施加在固定的I-407细胞单层的表面上，并在30℃下不摇动孵育过夜。
5. 通过倾析除去液体，使用1ml无菌PBS洗涤孔3次，无需孵育
6. 然后使用4％甲醛将I-407 /生物膜复合物固定15分钟
7. 鬼笔环肽 - 四甲基罗丹明异氰酸酯用于显现肌动蛋白，Hoechst 33258用于显现细胞核。为此，将鬼笔环肽 - 四甲基罗丹明异氰酸酯在无菌PBS中以1μg/ml的终浓度稀释，并加入Hoechst 33258，终浓度为1μg/ml。将该溶液加入孔中并在室温下孵育20分钟。孵育后，使用1ml无菌PBS洗涤孔5次，无孵育
8. 然后从24孔板中取出含有固定和染色的I-407 /生物膜复合物的盖玻片，并使用Vectashield将其固定在载玻片上。
9. 用共聚焦显微镜检查载玻片。在多聚甲醛固定的I-407 IEC单层上形成生物膜的实例如图1所示
10. 可以使用计算机程序COMSTAT1（Haydorn等人，2000）分析来自肠上皮细胞I-407单层表面的生物膜形成测定的图像的厚度和/或粗糙度。
  
  图1.不良生物膜产生器的生物膜形成的共聚焦分析（非致病性大肠杆菌K12菌株C600（A）和强生物膜产生器（粘附侵入性大肠杆菌在PFA固定的I-407肠上皮细胞单层的表面上，跨越> 菌株LF82（B）。表达GFP（绿色），肌动蛋白使用鬼笔环肽-TRITC染色为红色，DNA使用Hoechst.Bars，50μm染色为蓝色。

笔记

由于对这两种生物膜形成测定观察到高的变化，它们需要至少一式三份进行，包括对照。

食谱

最低必需培养基，补充有
10％（vol/vol）胎牛血清 1％的非必需氨基酸
1％的L-谷氨酰胺 1％青霉素/链霉素/两性霉素B溶液 1％的维生素混合物

致谢

这项研究得到了Ministèrede la Recherche et de la Technologie，the National National de laSantéet de la RechercheMédicaleand theUniversitéd'Auvergne（UMR Inserm 1071），the National National de la Recherche Agronomique（USC INRA 2018）并通过协会F. Aupetit（AFA）的资助。我们感谢CICS平台的共聚焦显微镜。该协议改编自以前发表的论文（Danese等人，2000; Naves等人，2008; Martinez-Medina等人， 2009; Chassaing和Darfeuille-Michaud，2013）。这项工作专用于Arlette Darfeuille-Michaud。

参考文献

Chassaing，B。和Darfeuille-Michaud，A。（2011）。共生性微生物群和肠病原体在炎症性肠病的发病机制中。胃肠病学 140（6）：1720-28。
Chassaing，B。和Darfeuille-Michaud，A。（2013）。 sigmaE通路参与克罗恩病相关的粘附侵入大肠杆菌的生物膜形成。 195（1）：76-84
Danese，PN，Pratt，LA，Dove，SL和Kolter，R。（2000）。外膜蛋白，抗原43介导大肠杆菌生物膜内的细胞与细胞的相互作用。 Mol Microbiol 37（2）：424-432。
Dirteuille-Michaud，A.，Neut，C.，Barnich，N.，Lederman，E.，Di Martino，P.，Desreumaux，P.，Gambiez，L.，Joly，B.，Cortot， JF（1998）。克罗恩病患者回肠粘膜中存在粘附的大肠杆菌菌株。 Gastroenterology 115（6）：1405-1413。
Martinez-Medina，M.，Naves，P.，Blanco，J.，Aldeguer，X.，Blanco，JE，Blanco，M.，Ponte，C.，Soriano，F.，Darfeuille-Michaud， Gil，LJ（2009）。生物膜形成作为粘附侵入大肠杆菌的新型表型特征（ AIEC）。 BMC Microbiol 9：202。
Heydorn，A.，Nielsen，A.T.，Hentzer，M.，Sternberg，C.，Givskov，M.，Ersboll，B.K.and Molin，S。（2000）。新型计算机程序COMSTAT对生物膜结构的定量。微生物学 146（Pt 10）：2395-2407。
Naves，P.，del Prado，G.，Huelves，L.，Gracia，M.，Ruiz，V.，Blanco，J.，Dahbi，G.，Blanco，M.，Ponte Mdel，C.and Soriano，F 。（2008）。毒力因子与大肠杆菌菌株体外生物膜形成的相关性。 Microb Pathog 45（2）：86-91
Valdivia，R.H.，Hromockyj，A.E.，Monack，D.，Ramakrishnan，L。和Falkow，S。（1996）。绿色荧光蛋白（GFP）在宿主 - 病原体相互作用研究中的应用。 Gene 173（1 Spec No）：47-52。