材料和试剂

鼠胚胎成纤维细胞（MEF）
无酚红HBSS（Gibco ，目录号：14175-079）
4-（2-羟基乙基）-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）（目录号：15630-080），</sup>
四甲基罗丹明甲酯（TMRM）（Life Technologies，目录号：T668）
环孢菌素H（Enzo Life Sciences，目录号：ALX-380-286-M001）
Hoechst 33342
羰基氰化物 - 对三氟甲氧基苯基腙FCCP（Sigma-Aldrich，目录号：C2920-10MG）
胰蛋白酶（451） - 胰蛋白酶，0.05％（1X）与0.53mM EDTA 4Na，液体，20×100ml
（Gibco ，目录号：25300096）

设备

IN Cell Analyzer 1000（General Electric Company）
37℃5％CO 2细胞培养箱
12孔板（Corning，Costar ，目录号：CLS 3513）
FACScan（BD）
离心机旋转速度：15,682,186×g（G力）（13,000rpm，半径8.3cm）

软件

IN Cell Investigator分析软件（通用电气公司）
BD CellQuest软件
FlowJo软件

程序

用于定量实时分析
1. 将细胞以50％细胞铺积铺板。
2. 将细胞在37℃下在具有10mM HEPES，20nM TMRM，2μM环孢菌素-H，多药物抗性泵活性抑制剂但不具有渗透性转变的酚红色HBSS中孵育30分钟孔（多药物抗性泵活性可影响用TMRM的线粒体上样）和2μg/ml Hoechst 33342，可用于活细胞的核染料。
3. 在用于TMRM（535nm激发滤光片; 600nm发射）和Hoechst 33342（360nm激发滤光片; 460nm发射波长）的机动化方式中注射4μMFCCP（3个时间点）（3个时间点））在不同的领域（每个孔获得4个视野，每个实验条件6个孔），每3分钟用IN CELL分析仪1000.
4. 使用IN Cell Investigator分析软件自动分析图像以测量TMRM强度。在第一和最后一个时间点对每个场随机选择的10个点的平均值测量荧光强度，对于每个场去除对应于没有细胞的区域的背景。
5. 在最后一个时间点（应用FCCP之后）测量的荧光强度通过在实验的第一时间点测量的荧光强度归一化。
用于FACS分析
1. 将细胞铺在50％汇合
2. 细胞被胰蛋白酶化（至少2百万个细胞）
3. 将细胞在G力13,62下离心5分钟
4. 将细胞在PBS中洗涤，重悬于含有10mM HEPES的无酚红的HBSS中并计数
5. 在2μM多药抗性泵抑制剂环孢菌素-H存在下，将细胞（每管300,000个细胞，每个条件重复三次）重悬于含有10mM HEPES和20nM TMRM的无酚红的HBSS中，并温育30分钟在37℃。平行地，细胞在相同条件下用解偶联剂（4μMFCCP）温育5分钟以测量特异性线粒体染色。
6. TMRM的FACS分析在具有CellQuest软件的BD FACScan上进行，并使用FlowJo软件分析。通过门控活细胞计算TMRM的荧光强度
7. FCCP的荧光强度通过没有FCCP的强度归一化，以排除强度差异仅仅或主要由细胞大小引起的可能性。

致谢

我们感谢文章的所有共同作者：Chiaravalli，M.，Mannella，V.，Ulisse，V.，Quilici，G.，Pema，M.，Song，X.W.，Xu，H。 Mari，S.，Qian，F.，Pei，Y。和Musco，G.，实验室的其他成员Boletta，Casari，G。和Cassina，L.和San Raffaele显微镜设备（Alembic）。

参考文献

Rowe，I.，Chiaravalli，M.，Mannella，V.，Ulisse，V.，Quilici，G.，Pema，M.，Song，XW，Xu，H.，Mari，S.，Qian，F.，Pei ，Y.，Musco，G。和Boletta，A。（2013）。多囊肾病中的葡萄糖代谢不足确定了一种新的治疗策略。 Med 19（4）：488-493。