材料和试剂

冰
[来自Merck& Co.的礼品]
GABA（Sigma-Aldrich，目录号：A2129）
孵育缓冲液：50mM Tris-柠檬酸盐缓冲液（pH7.1）
0.1M PBS（磷酸盐缓冲盐水，pH7.4）结合混合物（参见配方）

设备

幻灯片（Fisher Scientific，型号：HS15986）
标签箔
低温恒温器（Leica Microsystems，型号：CM1850）
-20℃冰箱
闪烁计数器
标尺
钻石抄写员
双面胶带
磷光转换器
旋风磷光成像仪（PerkinElmer）

软件

OptiQuant 4.0（PerkinElmer）
GraphPad放射性计算器（GraphPad软件）

程序

在快速断头后取出动物大脑，并浸入PBS浆液（0.1M，pH7.4）中以除去表面血液。一旦脑组织在干冰中冷冻，可将其包裹在标记的箔中并储存在-80℃下。
在低温恒温器中切割16微米厚度的冷冻切片，在载玻片上收集，并在-20℃冷冻箱中保存小于48小时。
在实验当天，玻片将达到室温; 不要打开包装盒，直到载玻片平衡到室温（在室温下约20分钟），以避免组织切片上过多的水分。之后，将选择幻灯片用于实验。
用50mM Tris-柠檬酸盐缓冲液（pH7.1）在4℃洗涤5分钟3次
让载玻片在室温下干燥（将玻片保持45分钟至1小时或更长时间）
在等待幻灯片干燥的同时
1. 制作"拍摄"解决方案：
  1. 理论"拍摄"："拍摄"是用于进行一系列稀释用于受体饱和分析的储备溶液。 [sup] 3 H]加波沙朵浓度的范围基于文献和先前的实验确定。然后将使用最高浓度来计算理论"拍摄"。例如，如果实验中使用的最高浓度为400nM的[3 H]加波沙朵，则添加到载玻片邮包中的总体积为7ml。加入到邮包中的10X原液置换剂溶液的体积为0.7ml;因此，需要6.3ml的 X 浓度的"Shoot for"。因此，"Shoot for"将计算为：
    X =（400 nM * 7 ml）/6.3 ml， X = 444.44 nM。
  2. 原件的体积（V） [³ H]加波沙朵使理论"拍摄"：
    V （μl）= V _t * X < SA是由制造商提供的放射性配体的比活性（Ci/mmol）。此外，相同配体的比活性在生产批次之间可能不同;
    X 是"Shoot for"的理论浓度（nM）;
    V _t是进行系列稀释所需的"Shoot for"的总体积（L）。因此， V _t = V ₁ + V ₂ _最高
    对于每个浓度，将存在"总"邮递（测量总结合，置换剂省略）和"空白"邮递（测量非特异性结合，置换剂添加）。例如，使用5,10,25,50,75,100,250和400nM的一系列浓度的[加3 H]加波沙朵，并且"Shoot for"的总体积： br /> （L）= [（5nM * 7ml/X）+（10nM * 7ml/X） X）... +（400nM * 7ml/X）] * 2
    1000
  3. 通过向 V _{t 添加 V （μl）原始[3H]加波沙朵，/sub> - V 孵育缓冲液}
2. 计数"拍摄"使用闪烁计数器通过等分10微升"拍摄"到5毫升闪烁液。基于计数，使用GraphPad Radioactive Calculator计算"Shoot for"的实际浓度。如果测量值接近理论浓度，则继续下一步。从这一点开始，原液的实际浓度将用于稀释计算
3. 将所需量的50mM Tris-柠檬酸盐缓冲液吸移到用总量或空白5,10,25,50,75,100,250和400nM的[3 H]加波沙朵标记的试管中，加入适当的使储液的体积达到指定浓度
4. 向标记为空白的管中加入0.7ml200μMGABA。
5. 计数混合物在16管中的计数。将基于这些计数计算每个试管中的[
将混合物从16个管中转移到正确标记的幻灯片邮件中。
将幻灯片放入指定的邮件。摇匀，然后将邮件在冰箱中在4℃下放置1小时
孵育后，将载玻片在冷Tris-柠檬酸盐缓冲液中洗涤两次，持续10 + 10秒，然后冷却dH 2 O 10秒。
让幻灯片干燥2-4小时或过夜。
打开幻灯片：将部分旁边的幻灯片重新标记，用标尺对齐部分，然后使用金刚石划片切割幻灯片。滑动端（带有一个部分）在断裂后将使用双面胶带进行录制。
将幻灯片放在荧光屏上; 转盘曝光时间约为48小时
通过使用Cyclone Phosphor Imager扫描曝光的荧光体转换屏获得结合图像

图1. [ ³ H]加波沙朵的放射自显影图像在四个月龄的Fischer Brown Norway大鼠脑组织（16μm厚度）中的GABA A受体结合。最高结合面积（圆圈）是内侧膝状体，而海马和皮质显示中度结合。

食谱

结合料
结合混合物由50mM Tris-柠檬酸盐缓冲液和含/不含200μMGABA的[3 H]加波沙朵组成

致谢

该协议改编自Richardson等人（2011）和Richardson等人（2013）。 NIH DC000151到DMC支持的工作。

参考文献

Richardson，B.D.，Ling，L.L.，Uteshev，V.V.and Caspary，D.M。（2013）。减少老年大鼠听觉丘脑中GABA（A）受体介导的强直抑制。 em> J Neurosci 33（3）：1218-1227a。
Richardson，B.D.，Ling，L.L.，Uteshev，V.V.and Caspary，D.M。（2011）。突触外GABA（A）受体和大鼠听觉丘脑的强直抑制。 PLoS One 6（1）：e16508。
Storustovu，S.I。和Ebert，B。（2006）。含δGABA A受体激动剂的药理学表征：突触后受体的功能选择性取决于缺失的γ2。 Pharmacol Exp Ther 316（3）：1351-1359。