材料和试剂

鼠4T1乳腺癌细胞（ATCC，目录号：CRL-2539）或在组成型活性启动子如巨细胞病毒控制下经工程改造以稳定表达萤火虫荧光素酶的任何目的细胞系。
注意：几种荧光素酶编码质粒是可商购的，并且通常使用基于pcDNA3.1或pBabe的主链来递送萤火虫或海肾萤光素酶。在任一情况下，使用抗生素施用来选择和维持荧光素酶在报道细胞中的稳定表达。
Cultrex：减少生长因子（RGF）基底膜提取物（BME）（Trevigen，目录号：3433-005-01）
冰
Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）（Life Technologies，目录号：10313-021）
青霉素/链霉素（Pen/Strep）（Gibco ，目录号：15140）
胎牛血清（Sigma-Aldrich，目录号：F1051）
D-luciferin，钾盐（15mg/ml）在无菌H 2 O中（Gold Bio，目录号：LUCK-1G）

设备

二维培养皿
白色壁，透明底96孔培养皿（Corning，Costar ，目录号：3610）
能够读取96孔板格式（Promega GloMax多检测系统或类似的生物发光板读数器）的照度计。
血细胞计数器或其他细胞计数方法
37℃/5％CO 2细胞培养箱

程序

细胞在补充有10％FBS和Pen/Strep（完全生长培养基）的DMEM中生长。
从活跃增殖，亚汇合的2D培养皿收获细胞
将细胞胰蛋白酶化，在过量的完全生长培养基中洗涤，并通过温和离心沉淀细胞。然后，将所得细胞沉淀物重悬浮并使其在完全生长培养基中恢复2小时
在此期间，用50μl100％Cultrex /孔包被96孔板，并允许在37℃凝胶。
注意：Cultrex必须始终保持在冰上，以防止随着凝胶温度升至> 4℃时出现的基质凝固。
使用血细胞计数器计数细胞，并将其稀释至1,000细胞在150μl的完全生长培养基中，其补充有4％Cultrex。彻底混合细胞和培养基/4％Cultrex溶液，然后将细胞铺在固化的Cultrex垫子顶部。
注意：4％Cultrex溶液不固化，因此，这些混合物中所含的细胞将容易附着于固化的Cultrex垫子，从而允许在整个实验中顶层培养基更换和/或替换。 br />
在铺板细胞之前，可以将其它化合物如生长因子或化学抑制剂与细胞和4％Cultrex溶液混合。每个实验条件应一式三份。
注意：所有测试化合物必须首先通过短期暴露进行筛选，以验证这些试剂不直接影响CMV驱动的荧光素酶的表达和/或荧光素酶：荧光素反应的活性。
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在接种细胞两小时后，通过加入2μlD-荧光素（15mg/ml）获得初始时间零（T0）发光读数，轻轻敲打板的侧面混合。
注意：在读板器中培养盖是打开的，因此，读板器必须保持清洁和消毒良好，并且可能位于层流罩中以防止不想要的细胞污染。此时无需更换培养基。
将培养物置于具有5％CO 2的37℃培养箱中
接种后4天，多细胞类器官将开始形成。获得第二个发光读数，如步骤7所述。之后，更换和刷新所有媒体和实验测试组件，非常小心不要破坏细胞和固化Cultrex坐垫。
注意：在这一点上，可以启动治疗方案以监测针对已建立的类固醇的各种化疗的抗癌活性。
对于所有实验条件，在接种后第8和11天重复步骤7-9。
注意：这些时间点可以根据所研究的细胞系的相对生长特性显着变化。因此，对于要研究的每个细胞系，需要根据经验确定纵向萤光素酶读数，给药方案和细胞铺板密度，以最大化信噪比。
使用Excel将每个发光值归一化为电镀后的初始T0值。

致谢

我们感谢Schiemann实验室的成员提出的有益的意见和建议。生物发光3D-器官型纵向生长测定从Wendt等人（2011）和Wendt等人（2013）改编。研究支持部分由国家卫生研究院提供给M.K.W. （CA166140），和W.P.S. （CA129359和CA177069）。

参考文献

Wendt，M.K.，Schiemann，B.J.，Parvani，J.G.，Lee，Y.H.，Kang，Y。和Schiemann，W.P。（2013）。 TGF-β刺激Pyk2表达，作为乳腺转移性生长所需的上皮 - 间质转化程序的一部分癌症。癌基因 32（16）：2005-2015。
Wendt，M.K.，Taylor，M.A.，Schiemann，B.J.and Schiemann，W.P。（2011）。需要下调上皮钙粘蛋白以启动乳腺癌的转移性生长。 em> Mol Biol Cell 22（14）：2423-2435。