材料和试剂

设备

程序

将大肠杆菌的单个菌落转移到5ml LB肉汤中。
将细菌在轨道细菌摇动培养箱中在37℃下以200rpm温育过夜（8小时）
将500ml LB肉汤用1/100体积的过夜培养的细胞接种注意：
1. 培养500ml时使用2L烧瓶。另外，由于5ml的1/100体积为50μl，因此在接种前，通过加入约900μl新鲜LB培养基来增加体积以减少细胞损失。
2. 根据蛋白质量，OMV的产量为每1升大肠杆菌培养物100μg。
细胞在37℃下以200rpm生长12小时。
将细胞在5,000xg下沉淀15分钟。
收集上清液级分并再次在5,000xg下沉淀15分钟。
收集上清液并使用真空泵通过孔径0.45μm的瓶顶过滤器过滤。
通过使用100kDa中空纤维膜的Quixstand Benchtop系统进行超滤，将过滤的上清液浓缩至50倍。
注意：由于OMV的产量非常低，为了在超速离心后获得可见的沉淀，细菌培养物的总体积应当大于5-7升。然而，根据所需的OMV的量，可以减少细菌培养物的体积以及浓度的程度。例如，将7L细菌培养物上清液浓缩，得到约280ml浓缩的上清液，将其装入总共四个超离心管（每个70ml）中。</em>
将浓缩的上清液再次通过0.22μm真空过滤器过滤以除去任何残留的碎片或细菌。
将所得滤液在4℃下以150,000×g超速离心3小时。
除去上清液，将沉淀（纯化的OMV）重悬于PBS中，并储存在-80℃直至使用。

图1.E的TEM图像。大肠杆菌 OMV

食谱

致谢

此协议改编自以前发表的作品（Kim等人，2013年）。这项工作得到了韩国教育，科学技术部的资助，21C前沿功能蛋白质组学项目的FPR08B1-240和韩国国家研究基金会（NRF）的中期职业生涯研究员资助由韩国政府MEST资助（No.20110000215和No.20120005634）。

参考文献

Kim，O.Y.，Hong，B.S.，Park，K.S.，Yoon，Y.J.，Choi，S.J.，Lee，W.H.，Roh，T.Y.，Lotvall，J.，Kim，Y.K.and Gho，用大肠杆菌外膜囊免疫可通过Th1保护细菌诱导的致死性和Th17细胞应答。 J Immunol 190（8）：4092-4102。
Lee，E.Y.，Choi，D.S.，Kim，K.P。和Gho，Y.S。（2008）。革兰氏阴性细菌外膜囊泡中的蛋白质组学。 Mass Spectrom Rev 27（6）：535-555。
Park，K.S.，Choi，K.H.，Kim，Y.S.，Hong，B.S.，Kim，O.Y.，Kim，J.H.，Yoon，C.M.，Koh，G.Y.，Kim，Y.K.and Gho，来自大肠杆菌的外膜囊泡诱导全身性炎症反应综合征。/a> PLoS One 5（6）：e11334。