材料和试剂

定时胚胎小鼠胚胎：广泛的发展时间点对于该程序工作非常好，从E10-18.5。注意，早期的胚胎（E10-12.5）是非常精致，可能需要修改vibratome切片技术和/或手动切割与微刀，可以嵌入胶原3D凝胶（以帮助保存组织结构）和培养Millicell插入或作为全脑外植体漂浮在多孔板中的营养/旋转器上过夜。同样地，较老的胚胎E17-18将具有更发达的皮肤和颅骨，需要更多的力量将DNA溶液注射到心室，其相对于动物的尺寸变得更小。
（≥1μg/μl）制备的DNA：Qiagen Maxi Prep试剂盒（QIAGEN，目录号：12663）或EndoFree质粒试剂盒（QIAGEN，目录号：12362）
快速绿FCF（Sigma-Aldrich，目录号：F7252）
HBSS（Life Technologies，目录号：14025-126）
4％低熔点琼脂糖（无菌1×PBS或1×HBSS）
低熔点琼脂糖（GeneMate Sieve GQA琼脂糖，目录号：E-3112）
冰
Kimwipe

设备

35毫米培养皿
多孔细胞培养皿（12至24孔）
电穿孔仪（BTX The Electroporation Experts，型号：ECM 830方波电穿孔系统）
3 mm桨铂金Tweezertrodes（BTX电动专家，型号：45-0487）
ECM 830脚踏开关（BTX The Electroporation Experts，型号：1250FS）
口腔移液管（Sigma-Aldrich，目录号：P0799-1PAK）
微量移液器（Borosilicate，长丝O.D .: 1mm，I.D .: 0.78mm，10cm长）（SUTTER INSTRUMENT，目录号：BF100-78-10）
微量拔管器P-97/IVF（SUTTER仪器）
解剖立体镜灵活的照明
杜蒙镊子（＃5和＃55）（Fine Science Tools）
一次性塑料移液管
无菌手术刀
用于检查转染的荧光解剖立体镜
数码相机（如有必要）（OLYMPUS，型号：MVX10）

程序

收集定时胚胎小鼠胚胎根据批准的协议在您的机构。抓住胚胎在冰冷的HBSS填充盘，直到准备使用。
将融化的琼脂糖倒入35mm皿中〜1/2至2/3满，并在冰上固化。
用刀片从餐具中心切下一个小梯形，丢弃（图1A）。
用HBSS填充这个菜几乎完全（图1A）。
使用切割移液管或钳子将单个胚胎转移到这个皿的孔中（图1A）
填充微量移液器与DNA溶液混合足够的快速绿色只是可视化
定位胚胎在井，用钳子保持在位，同时微注射约0.2-0.5微升DNA到侧脑室。将胚胎翻转，重新定位和微注射DNA进入对侧脑室注意：由于有色溶液，每个脑室应该可视化（图1A）。
保持镊子在头部以目标电流进入背部新皮层注意：目标位置高度依赖于tweezertrodes的方向。例如，将正电极保持在脑的一侧的背侧新皮质上意味着负电极将被放置在更腹侧/对角位置，略微在对侧颌下方。这是最容易实现的，另一只手（即左）使用另一对钳子，而另一只手握住镊子（右）。
使用远程脚踏开关进行电穿孔胚胎：3-5个脉冲，35 mV，100 ms间隔。
翻转胚胎，相应地重新定位镊子，并使用相同的程序重新电穿孔对侧大脑皮层。
注意：
1. 不同的电极放置可以针对其他特定区域，包括海马/牙齿，腹侧端脑，以及其他包含腔的区域。
2. 在电穿孔期间，最好不要直接接触胚胎。
转移电穿孔胚胎放置在冰上与HBSS的多孔皿，使用切割移液管/镊子恢复。
每次胚胎电穿孔后，用干燥的Kimwipe擦拭，清洁电极。
重复程序，直到所有胚胎都已电穿孔。
注意：在此子程序中可以使用多种不同的DNA构建体和组合。
从每个胚胎解剖大脑，并转移到冰冷的HBSS在新的多孔板，直到所有的大脑被删除。
注意：在某些情况下，根据胚胎的实际年龄，可以去除脑膜，以帮助振动切片，较年轻的胚胎更脆弱（E10-12）。
将大脑插入4％低熔点琼脂糖中，并准备振动切片和器官型脑切片培养，如（参见胚胎脑部的器官切片培养（Calderon de Anda，2013）。
第二天可以用荧光立体镜观察切片。实践中，多个切片应该在每个新皮层中包含荧光细胞。例如，图1B显示了在野生型胚胎中靶向每个新皮层的表达RFP的质粒的典型实例。图1C，D是靶向转基因GFP表达动物的每个新皮层的RFP的实例（Nelson等人，2013）。

图1.胚胎小鼠新皮质中的 Ex utero 电穿孔。 A.技术示意图; B.靶向野生型E14.5小鼠中每个新皮层的双电穿孔RFP质粒的实例，所述野生型E14.5小鼠培养过夜; C.靶向转基因Tbr2GFP E14.5新皮层中的每个新皮层的双电穿孔RFP质粒的实例; D.大功率视图。黑色和红色分别代表负电极和正电极，因此记住它们的取向，因为它控制方向和靶向：绿色代表填充侧脑室的快速绿色DNA溶液，显示它们的形状，并指示成功的填充。 /> 注意：使用配备有GFP/RFP滤光片组和数码相机（Olympus，MVX10）的荧光立体镜获得图像。

致谢

该方案改编自Nelson等人（2013），并且由NIH Grants R21 MH087070和RO1 MH080766-S至R.F.H.支持。

参考文献

Calderon de Anda，F。（2013）。胚胎脑切片的器官切片培养。生物方案， 3（3）：http://www.bio-protocol.org/wenzhang.aspx?id=327。
Ge，X。（2012）。在子宫内小鼠胚胎脑的电穿孔。生物协议 2（13）：e231
Nelson，B.R.，Hodge，R.D.，Bedogni，F.and Hevner，R.F。（2013）。胚胎小鼠新皮层中间神经源性祖细胞和放射状胶质细胞之间的动态相互作用：Dll1-Notch信号传导中的潜在作用。 J Neurosci 33（21）：9122-9139。