材料和试剂

R。胶囊受体菌株
RCV肉汤
RCV琼脂
蔗糖
L-苹果酸（Sigma-Aldrich，目录号：240176）
盐酸硫胺素（Sigma-Aldrich，目录号：T1270）
能够共轭的大肠杆菌克隆菌株（例如 S17-1）
自杀质粒，例如包含sacB基因和抗生素抗性基因但没有荚膜红细菌相容来源的pZJD29A（Z.Jiang和CE Bauer，未公开的菌株构建）的复制。自杀质粒pZJD29A是pJP5603的衍生物，具有基于RK6的复制起点，使其成为"通用"自杀质粒（Penfold和Pemberton，1992）。
合适的抗生素（由自杀质粒指定的抗性）
RCV肉汤/琼脂（Beatty和Gest，1981）（参见Recipes）
微量元素溶液（在250ml dH 2 O中）（参见配方）

设备

30℃摇床
30& C孵育器
试管
培养皿

程序

亚克隆〜1kb的上游序列加上待缺失的基因的前几个密码子到pUC19或类似载体中。在所得质粒中，克隆待删除基因的最后几个密码子加〜1kb的下游序列。通过PCR扩增整个区段并克隆到包含sacB和抗生素抗性基因的自杀质粒（例如pZJD29A）中。一定要设计你的构建，使删除的基因的第一个和最后几个密码子是框架内。这种克隆在E中完成。大肠杆菌。
将删除构建体共轭到中（请参阅"

"细菌共轭"
连接共轭的R。补充有合适的抗生素（即自杀质粒上的抗生素抗性）的RCV琼脂平板上的荚膜囊泡。生长的菌落代表单一交换事件。
通过PCR确认单一交换事件，或在RCV，RCV +抗生素和RCV + 10％蔗糖上划线菌落。它们应当在RCV和RCV +抗生素上生长，而不是在RCV + 10％蔗糖上生长，因为sacB基因在蔗糖存在下导致毒性，并且只有单个交换事件将维持sacB em>基因
用确认具有单次交叉的菌落接种10ml RCV（NO抗生素），并在30℃下孵育，在250rpm下摇动3-5天。
在微量离心管中离心1ml该培养物，倾析上清液，并在100μlRCV肉汤中重悬细胞沉淀。
将扩散细胞悬浮液在RCV + 10％蔗糖琼脂平板上，在30℃孵育4-7天。
生长的菌落应重新划线在RCV，RCV +抗生素和RCV + 10％蔗糖上。双交换（即，染色体框内缺失突变体）应当在RCV和RCV + 10％蔗糖上生长，但不在RCV +抗生素上生长，因为第二交叉事件导致 > sacB 基因和抗生素抗性基因
通过PCR确认染色体框内缺失突变体，因为第二次交叉可以导致WT或KO，其将在RCV和RCV + 10％蔗糖上生长，而不在RCV +抗生素上生长。

食谱

RCV肉汤/琼脂（Beatty和Gest，1981）（在1L中;高压灭菌） 4克D，L-苹果酸 1 g（NH 4）2 SO 2 4
10mM磷酸钾缓冲液 200mg MgSO 4。<7h> 7H 2 O 75mg CaCl 2 2 ^。 2H 2 12mg FeSO 4 ^。 7H 2 O
20mg Na 2 EDTA 1 ml微量元素溶液
1mg盐酸硫胺素在高压灭菌之前用NaOH将pH调节至6.8 （用于琼脂加1.5％琼脂）
微量元素溶液（在250ml dH 2 O中） 0.7 g H sub 3 BO sub 3
398mg MnSO 4 。 H O
188mg Na 2 MoO 4 ^。 2H 2 60mg ZnSO 4 ^。 7H 2 O
10毫克Cu（NO 3）n。3 H 2 O 2。

致谢

该方案的开发由授予J.T.B.的资助。来自加拿大健康研究所。该协议改编自Beatty和Gest（1981）和Penfold和Pemberton（1992）开发的方案。

参考文献

Beatty，J.T.和H.Gest（1981）。在光合细菌中产生琥珀酰辅酶A。 Arch Microbiol 129（5）：335-340。
Leung M.M.，Brimacombe C.A.，Spiegelman G.B.，and Beatty J.T. （2012） GtaR蛋白负调节gtaRI操纵子的转录并调节基因转移剂（RcGTA）在红细菌中表达。 Mol Microbiol 83（4）：759-74。
Leung，M。和Beatty，J.T。（2013）。红细胞肺泡杆菌中的细菌结合。生物协议 3（13）：e804。
彭福尔德和Pemberton，J.M（1992）。用于在细菌中构建染色体插入突变的改进的自杀载体。 Gene 118（1）：145-146