材料和试剂

1.无 RNase 移液器吸头 [Genesee Scientific，目录号：23-130R (10 µL)、23-150R (200 µL)、23-165R (1,250 µL)]
2.1.5 mL 离心管（Genesee Scientific，目录号：22-282）
3.50 mL 离心管（ Genesee Scientific，目录号：21-108 ）
4.15 mL 离心管（ Genesee Scientific，目录号：21-103 ）
5.培养皿（ Genesee Scientific，目录号：32-106 ）
6.尼龙网（网孔尺寸 100 µm）（NITEX，目录号：NTX100-098 ）
7.液氮
8.Phusion 高保真 DNA 聚合酶（ Thermo Fisher Scientific，目录号：F-530XL ）
9.In-Fusion HD cloning plus（Takara，目录号：638911）
10.Murashige和 Skoog 培养基（MS）（ PhytoTech Lab，目录号：M524 ）
11.IGEPAL CA-630（ MilliporeSigma ，目录号：I8896）
12.GFP-Trap 磁性琼脂糖（ ChromoTek ，gtd-20）
13.十二烷基硫酸钠（SDS）（ MilliporeSigma ，目录号：L3771-500G）
14.β-巯基乙醇( MilliporeSigma , M3148-250ML)
15.甘油（ Thermo Fisher Scientific，目录号：J16374.K2）
16.糖原 RNA 级（ Thermo Fisher Scientific，目录号：R0551）
17.NEBNext多重小 RNA 文库准备集（New England Biolabs，目录号：E7300）
18.10 bp O'RangeRuler DNA ladder（ Thermo Fisher Scientific，目录号：SM1313）
19.氯化钠 (NaCl)（ Thermo Fisher Scientific，目录号：AAJ2161836）
20.DEPC 处理水（ Thermo Fisher Scientific，目录号：4387937）
21.Trizma碱基（ MilliporeSigma ，目录号：T1503 ）
22.TRI 试剂（MRC，目录号：TR118）
23.Clorox 杀菌漂白剂（ Thermo Fisher Scientific，目录号：Essendant CLO30966EA）
24.Triton X-100 溶液（ MilliporeSigma ，目录号： 93443）
25.溴酚蓝（ MilliporeSigma ，目录号：B0126）
26.的、不含 EDTA 的蛋白酶抑制剂混合物（ MilliporeSigma ，目录号：11836170001 ）
27.GFP 抗体（ MilliporeSigma ，目录号：11814460001）
28.氯仿（ Thermo Fisher Scientific，目录号： 423550040）
29.异丙醇（ Thermo Fisher Scientific，目录号： 423835000）
30.6 × DNA 上样染料（ Thermo Fisher Scientific，目录号：R0611）
31.溴化乙锭（ Thermo Fisher Scientific，目录号：J67270.14）
32.乙酸钠（ Thermo Fisher Scientific，目录号： A13184.30）
33.种子杀菌溶液（见食谱）
34.2 ×蛋白质 SDS 上样缓冲液（见配方）
35.IP裂解缓冲液（参见配方）
36.洗涤缓冲液（见配方）
37.5 × TBE 缓冲液（见配方）
38.12% 聚丙烯酰胺凝胶（见配方）
39.8% SDS-PAGE 分离凝胶（见配方）
40.SDS-PAGE 浓缩胶（参见配方）
41.3 M 醋酸钠 (pH 5.2) （参见食谱）

设备

1.植物生长室（Percival，型号：CU36L5）
2.微量离心机（Eppendorf，型号：5424R）
3.高速离心机（贝克曼计数器，型号：Avanti JE系列）
4.DynaMag-2 磁体（Invitrogen，目录号：12321D）
5.H5600 左轮管混合器（VWR，目录号：H5600-15）
6.热循环仪（Bio-Rad，目录号：1851148）
7.刀
8.Thermomixer C（Eppendorf，目录号：5382000015）
9.抹刀
10.研钵和研杵
11.Mini-PROTEAN tetra 垂直电泳槽（Bio-Rad，目录号：1658001FC）

程序

A.质粒构建和植物转化

1.选择根细胞类型特异性启动子 [ Endodermis 7 ( EN7 )用于内皮层， Acaulis5 ( ACL5 )用于后生木质部/原形成层用于本研究]，并从拟南芥基因组 DNA 中扩增它们。
2.使用 PCR（ Phusion 高保真 DNA 聚合酶）从 pMDC107 质粒和包含来自拟南芥基因组 DNA的编码区和 3' UTR 的 AGO1 基因组序列扩增GFP编码序列。根据套件手册，使用 In-Fusion HD 克隆 plus 将它们与根细胞层特异性启动子组装到 pCambia1300 中。在GFP和AGO1之间插入了五个氨基酸的接头序列 (GGGGA) 。将重组构建体转化到大肠杆菌DH5α 感受态细胞中进行验证 ( Renzette , 2011)。
3.将构建体转化到根癌农杆菌中 GV3101通过电穿孔。转基因品系由农杆菌介导的花浸转化产生（Clough 和 Bent，1998）。
4.含有抗生素的1/2 MS（半强度Murashige和 Skoog 培养基）上培养转基因株系来选择纯合单插入转化体，并将其用于后续实验。

B.植物材料准备和收集

1.H5600 左轮手枪管混合器上以 18 rpm 的速度轻轻旋转，用种子灭菌溶液灭菌 10 分钟。
2.以 2,000 x g的速度短暂旋转20 秒以沉淀种子并丢弃漂白剂溶液。
3.用无菌水重新悬浮种子，并在H5600 左轮手枪管混合器上以 18 rpm 的速度轻轻旋转 1 分钟以清洗种子。重复五次。
4.将尼龙网切成 9 × 9 厘米的正方形，以适应 150 毫米的培养皿。高压灭菌 20 分钟。
5.无菌罩中 ½ MS 培养皿的顶部。
6.在尼龙网顶部的一条线上，每个培养皿播种500粒种子。在 16 小时光照和 8 小时黑暗和22°C 下垂直种植植物9 天。
注意：200 μL转基因种子可以播种到 10 个平板中，并产生 2 – 3 g 根组织。
7.上方约 2 厘米处用刀片将根切掉，以收获根。
注意：定期更换刀片，以免切片时损坏根部。

C.GFP-AGO1 免疫沉淀

1.取 2 g 根组织在液氮中研磨成细粉，加入 4 mL 新鲜制备的 IP 裂解缓冲液。
2.° C下以 18 rpm的速度轻轻旋转孵育30 分钟。
3.16,000 离心 × g 4 ° C 20 min，去除不溶性碎片，再重复此步骤一次。
4.转账 100 µL 上清液到新管中。加 100 µL 2 ×蛋白SDS上样缓冲液，95 ℃加热5分钟。将样品储存在-20 ° C 用于蛋白质印迹。
5.预洗 50 µL GFP-Trap 磁性琼脂糖珠与 1 mL 的 IP 裂解缓冲液。用磁性支架分离珠子并丢弃上清液。再重复此步骤两次。
6.将步骤 C3中剩余的上清液转移到新管中，并添加预洗的 GFP-trap 磁性琼脂糖珠。
7.在 4°C 的旋转器上孵育 2 小时。
8.将管子放在磁性支架上，去除上清液。用 1 清洗珠子通过在 4°C 下旋转管子 5 分钟来获得 mL 的洗涤缓冲液。使用磁性支架将珠子与上清液分离并丢弃上清液。再重复此步骤四次。
9.在 200 µL 洗涤缓冲液中重悬珠子并转移 20 µL（样品的 10%）放入新管中进行蛋白质印迹分析。样本的其余部分应保留用于 RNA 提取，并称为 RNA 样本。
10.使用磁性支架将珠子与蛋白质印迹样品中的上清液分离并丢弃上清液。用 20 重悬珠子 µL 1 × SDS 加载缓冲液并将样品在 95 ° C 下加热 5 分钟。使用磁性支架将珠子与上清液分离，并将上清液转移到新管中进行蛋白质印迹分析。
11.使用磁性支架将珠子与 RNA 样品中的上清液分离并丢弃上清液。
12.加500 µL 的 TRI 试剂到珠子以重新悬浮珠子。
13.向管中加入 100 µL 氯仿，剧烈摇晃，让样品在室温下静置 5 分钟。
14.将混合物以 10,000 rpm 和 4 °C离心15 分钟。
15.将水相转移到新管中并加入 20 µg 糖原。
16.在水性液体中加入等体积的异丙醇，颠倒数次混匀，-20 ℃孵育60分钟。
17.°C下以 10,000 rpm 离心 15 分钟。
18.丢弃上清液并用 70% 乙醇清洗 RNA 颗粒。
19.去除上清液并在室温下风干颗粒。
20.将 RNA 溶解在 7 µL 无核酸酶水。 RNA可保存于-80 ℃ ，用于小RNA文库构建。

D.用于免疫沉淀质量控制的蛋白质印迹分析

1.加载 20 在 8% SDS-PAGE 凝胶上，步骤 C4 的粗提物和步骤 C9 的 GFP-AGO1免疫沉淀的每份样品 µL。
2.按照 SDS-PAGE 电泳和蛋白质印迹的协议使用 GFP 抗体检测 GFP-AGO1（Mahmood 和 Yang，2012）。 GFP-AGO1 的大小约为 157 kDa 。

E.根细胞层特异性 AG O1 结合小 RNA的全基因组检测

根据手册（ http://www.neb.com/protocols/2018/03/27/protocol-for-use-with-nebnext _ _ _ -small-rna-library-prep-set-for-illumina-e7300-e7580-e7560-e7330 ）。

F.用于测序的 sRNA 文库回收

1.制作 12% 的聚丙烯酰胺凝胶。
2.加入6 × DNA loading dye，用移液器吹打混匀，将样品上样到凝胶中。加载 10 µL 10 bp O'RangeRuler DNA 阶梯进入同一凝胶。
3.× TBE 缓冲液中以 150 V进行凝胶电泳90 分钟。
4.× TBE 缓冲液中用溴化乙锭染色凝胶5 分钟。切掉 140 – 150 bp 的条带。
5.将凝胶片放入 1.5 mL 离心管并使用移液器吸头将凝胶粉碎成小块。
6.加500 将 0.4 M NaCl 的 µL 放入管中，通过将样品旋转 6 小时或在 4 ° C下过夜，从凝胶中洗脱 sRNA 文库 DNA 。
7.在 15,000 × g和室温下离心管 1 分钟，并将上清液转移到新管中。重复此步骤两次；避免将任何凝胶转移到试管中。
8.加入1/10体积的3M醋酸钠、2倍体积的100%乙醇和20μg糖原，混匀，-20 ℃放置6小时。
9.16,000 × g离心在 4 ° C 下放置 30 分钟以沉淀文库。丢弃上清液并用 70% 乙醇清洗颗粒。
10.16,000 离心 ×克在 4 ° C 下放置 10 分钟，弃去上清液，然后风干沉淀。
11.将文库 DNA 溶解在 30 µl 无核酸酶的水中。
12.使用自制管道pRNASeqTools ( https://github.com/grubbybio/pRNASeqTools )处理小型RNAseq数据。

数据分析

小型RNAseq数据由pRNASeqTools管道分析。简而言之，适配器序列由cutadapt 3.0 修剪。使用Shortstack将修剪后的读数映射到基因组Araport 11 。映射读取通过计算 RPM（每百万映射读取读取数）值进行归一化。

食谱

1.种子杀菌液
50% Clorox 杀菌漂白剂
0.05% 海卫 X-100

2.2 ×蛋白质 SDS 上样缓冲液
100 毫米 Tris-Cl (pH 6.8)
4% (w/v) SDS（十二烷基硫酸钠；电泳级）
0.2% (w/v) 溴酚蓝
20% (v/v) 甘油
200 mM β-巯基乙醇

3.IP裂解缓冲液
50 毫米 Tris (pH 7.5)
150 毫米氯化钠
4 毫米氯化镁2
2毫米数字地面电视
10% 甘油
0.1% IGEPAL CA-630
1 × EDTA-free 蛋白酶抑制剂混合物
储存在 4 ° C 。

4.洗涤缓冲液
50 毫米 Tris (PH 7.5)
150 毫米氯化钠
4 毫米氯化镁2
2毫米数字地面电视
10% 甘油
0.5% IGEPAL CA-630
1 × EDTA-free 蛋白酶抑制剂混合物

5.5 × TBE缓冲液
450 mM Tris碱基
450 mM 硼酸
10 毫米乙二胺四乙酸
酸碱度 8.3

6.12%聚丙烯酰胺凝胶
8.85 mL ddH 2 O
1.5 mL 的 5 × TBE 缓冲液
4.5 mL 的 40% 丙烯酰胺/双溶液 (29:1)
105 µL 10% APS
5.25 µL 的 TEMED

7.8% SDS-PAGE 分离胶
2.65 mL ddH 2 O
1 mL 40% 丙烯酰胺/双溶液 (29:1)
1.3 mL 的 1.5 M Tris (pH 8.8)
50 µL 10% SDS
50 µL 的 10% APS
2 µL 的 TEMED

8.SDS-PAGE 浓缩胶
1.51 mL ddH 2 O
0.20 mL 的 40% 丙烯酰胺/双溶液 (29:1)
0.25 mL 的 1.5 M Tris (pH 8.8)
20 µL 10% SDS
20 µL 的 10% APS
2 µL 的 TEMED

9.3 M 醋酸钠 (pH 5.2)
3M乙酸钠
使用冰川酸将 pH 值调节至 5.2

致谢

该协议改编自我们之前的工作 (Fan et al., 2022)。这项工作得到了美国国立卫生研究院 (GM129373) 对陈雪梅的资助。

利益争夺

作者声明没有利益冲突。

参考

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