流式细胞术检测早期细胞凋亡之JC-1法

材料与试剂

1. 5 ml流式管 (Falcon, catalog number: 352008)
2. 15 ml离心管 (BD Falcon, catalog number: 352097)
3. 70 μm细胞过滤筛 (Falcon, catalog number: 352350)
4. HeLa细胞 (中国科学院细胞库，SCSP-504)
5. 胰酶 (Gibco™, catalog number: 27250018)
6. DMSO (Sigma-Aldrich, catalog number: D2650)
7. JC-1染色试剂盒 (BD™, catalog number: 551302)
8. NaCl
9. Na₂HPO₄ 
10. KCl 
11. KH₂PO₄
12. H₂O₂
13. 1× PBS缓冲液 (见溶液配方)
14. 20 mM H₂O₂ (见溶液配方)
15. 染色缓冲液 (见溶液配方)
16. JC-1染色液 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. CO₂培养箱 (Heraeus, model: HERAcell 150)
2. 水平离心机 (BeckmanCoulter, model: Allegra X-12R)
3. 旋涡混匀器 (Scientific Industries, model: Vortex-Genie 2)
4. 流式细胞分析仪 (BD LSRFortessa，配有355 nm/405 nm/488 nm/561 nm/638 nm五根激光器)
5. 倒置显微镜 (Olympus, model: IX73)
   

实验步骤

1. 过氧化氢诱导细胞凋亡
   处于对数生长期的HeLa细胞，加入终浓度为0.8 mM H₂O₂后，放入5% CO₂培养箱中37 °C继续培养，诱导细胞凋亡。3小时后，镜下观察发现，与没有加H₂O₂的对照组细胞相比，约有30%细胞变圆，确定有细胞出现凋亡。
2. 收集细胞
   先轻轻吹打贴壁不牢的细胞使其脱落，将培养液上清收集到15 ml离心管中；贴壁细胞用0.05%胰酶消化，得到的细胞悬液并入相应的装有上清的离心管中；细胞计数确定细胞量。常温，300 × g离心5分钟，弃上清，加入100 μl PBS重悬细胞，取约1 × 10⁶细胞作为一个反应体系进行后续实验。
   
3. JC-1染色
   每管加入500 μl新鲜配制并37 °C预热的JC-1染色液，重悬细胞，放入5% CO₂培养箱中37°C避光孵育15分钟。
4. 清洗
   每管加入2 ml 1×染色缓冲液，混匀。常温，300 × g离心5分钟，弃上清。旋涡混匀器中速，将细胞轻轻重悬，再加入1 ml 1×染色缓冲液，混匀。常温，300 × g离心5分钟，弃上清。用500 μl 1×染色缓冲液重悬细胞，样品经过滤后转移至流式管，尽快上机检测。
5. 上机，采集流式数据分析样本
   在BD LSRFortessa流式细胞仪上，使用488 nm激光激发，530/30滤光片收集发绿色荧光的JC-1单体信号；用561 nm激光激发，586/15滤光片收集发红色荧光的JC-1聚合物信号。
   

结果与分析

通过前向散色光信号 (FSC) 和侧向散色光信号 (SSC)，排除细胞碎片，圈出主群细胞 (图1A、1C)。再通过JC-1的荧光信号，判定对照组和H₂O₂诱导组细胞的凋亡情况 (图1B、1D)。对照组HeLa细胞线粒体膜电位处于较高水平，JC-1聚集在线粒体的基质中形成聚合物发出红色荧光，如图1B所示。图1D中，H₂O₂诱导凋亡组有部分红色荧光信号转化为绿色荧光信号，说明线粒体膜电位处于较低水平，提示这群细胞处于凋亡早期。我们正是通过JC-1从红色荧光到绿色荧光转变的现象，来发现细胞膜电位的变化，进而作为细胞凋亡早期的一个检测指标。需要注意的是，线粒体膜电位变化的检测属于电化学方法，pH值的改变会影响细胞膜电位变化，所以在应用时需保持染液pH值前后一致。


图1. JC-1染色分析细胞早期凋亡. A、B为未用H₂O₂诱导的Hela细胞，C、D为H₂O₂诱导的Hela细胞。

注意事项

1. 实验用储液应避免反复冻融，可小管分装避光保存；工作液现用现配。
2. 制备JC-1染色液时需旋涡混匀器充分混匀，如有少量沉淀出现，可通过离心去除。
3. 对于贴壁细胞可以先将细胞制成单细胞悬液后再染色制样，染色前需将染色缓冲液37°C预热，JC-1染色液避光37°C温浴；染色全程需在37°C、避光进行；脱色清洗和离心时建议常温，不要低温。
4. 待样本制备完成后，尽量在30分钟内完成上机检测，在上机前样本需冰浴避光保存。为确保分析精度，上机检测时以低速进样，每秒事件数不大于400为宜。
5. 若样品中有肉眼可见的团块或者聚集体，可用200目尼龙网过滤后再上机检测。
6. JC-1单体的最大激发波长为515 nm，最大发射波长为529 nm；JC-1聚合物的最大激发波长为585 nm，最大发射波长为590 nm。实验中所用的BD LSRFortessa流式细胞分析仪，配有488 nm和561 nm激光器。根据仪器的配置JC-1单体由488激光器激发，采集530/30波段的绿色荧光信号；JC-1聚合物由561激光器激发，采集586/15波段的红色荧光信号。如仪器只配有488激光，则采集由其对应的FITC和PE的检测通道收集信号即可。
   

溶液配方

1. 1× PBS缓冲液
   NaCl           8.0 g
   Na₂HPO₄  1.44 g
   KCl             0.2 g
   KH₂PO₄    0.24 g
   溶于1 L的ddH₂O中，调pH值为7.2~7.4
   过滤灭菌
   4 °C保存
2. 20 mM H₂O₂溶液
   取30% H₂O₂ 2 μl稀释于880 μl PBS溶液中
   
3. 染色缓冲液
   用于配制染色液和染色后的细胞清洗。试剂盒中配有10×储液。使用前，先将10×储液置37 °C水浴中温浴，确保溶液澄清各组分充分溶解，用无菌去离子水稀释成1×染色缓冲液，实验前新鲜配制，并置于37 °C预热备用
   
4. JC-1染色液
   将一管粉末溶于125 μl DMSO配成200 μM储液，小管分装后避光冻存于-20 °C。实验前以1:100稀释于37 °C预热的1×染色缓冲液，用旋涡混匀器充分混匀。按照每份样品 (1 × 10⁶细胞/毫升) 用500 μl染色，估算实验中所需的JC-1染色液用量，现用现配，用前先置于37 °C避光温浴
   

致谢

感谢中科院生物化学与细胞生物学研究所细胞分析技术平台的全体成员的建议和帮助。

参考文献

1. Sivandzade, F., Bhalerao , A. and Cucullo, L. (2019) Analysis of the mitochondrial membrane potential using the cationic JC-1 dye as a densitive fluorescent probe. Bio-Protocol 9(1): 5-9.
2. Wlodkowic, D., Telford, W., Skommer, J. and Darzynkiewicz, Z. (2011). Apoptosis and beyond: cytometry in studies of programmed cell death. Methods Cell Biol 103: 55-98.