湖泊水体环境DNA的采集、提取与鱼类遗传标记的扩增

研究背景

环境DNA技术是近年来新兴的一种生物多样性调查方法，可以通过分子生物学手段 (如：DNA提取、PCR扩增、高通量测序等)，从环境样本中直接获取生物DNA，对目标物种进行遗传标记的识别。与传统生物多样性调查方法相比，环境DNA技术具有灵敏度高、省时省力、无创采样等优点，而且不要求调查人员具有传统的生物识别与鉴定经验。基于高通量测序的环境DNA宏条形码技术可以从一份环境样品实现对目标类群的多个物种的DNA检测，是评估鱼类多样性的有力工具。近年来, 环境DNA宏条形码技术已被广泛运用于淡水和海洋生态系统的渔业管理与鱼类多样性监测中，包括对池塘、溪流、湖泊、河流和海湾等不同水生态系统的鱼类物种组成、鱼类群落结构以及鱼类群落时空分布变化的监测（Keskin et al., 2016; Li et al., 2018; Sigsgaard et al., 2017），在水生生态系统的保护工作中具有广阔的应用前景。Evans等（2017）使用3对鱼类通用引物从面积为2.2公顷的水库中检测出过去传统方法监测到的所有鱼类物种，另外还检测到11种过去未捕获过的鱼类。Balasingham等（2018）使用COI标记从加拿大南部的Grand河流和Sydenham河流中共检测出78种本地鱼类、4种濒危鱼类以及1种入侵鱼类，其检测结果与历史监测结果基本一致。Griffiths等（2020）发现与电捕相比，环境DNA宏条形码技术提高了对英国濒危鱼类欧洲鳗鲡（Anguilla anguilla）的检出率，同时能在采样点检出较高的鱼类多样性。这些研究结果不仅证明了环境DNA宏条形码技术监测目标水域鱼类多样性的有效性，还表明了环境DNA技术更容易检测到相较于传统方法难于捕捉到的稀有物种或隐蔽物种。然而，环境DNA宏条形码无法提供目标物种的种群数量、年龄结构、生理状态和生长发育阶段等信息。其次，环境DNA宏条形码分析依赖分子数据库的完整性，当数据库缺少目标序列时则会导致假阴性检测（Cristescu et al., 2018）。此外，由于水体中环境DNA动态机制的复杂性（Barnes and Turner, 2015），通过环境DNA序列丰度评估物种相对生物量的准确性还有待进一步的研究（Ushio et al., 2018）。尽管环境DNA技术存在一定的局限性，无法完全替代传统的鱼类调查方法，但可以作为一种重要的补充工具，用于快速反映鱼类多样性和鱼类空间分布，减少传统监测对水生生态系统的干扰，缩短调查周期，提高检测效率，为水生生态保护的迅速应答提供可靠数据。目前环境DNA研究针对不同的研究类群和研究水域采用的实验方案均有所不同（Shu et al., 2020），不利于初学者学习环境DNA技术以及开展相关研究，因此总结一套常用的标准流程十分重要。环境DNA宏条形码技术主要由环境DNA获取、遗传标记扩增、高通量测序与测序结果分析四个部分组成，由于环境DNA的获取与遗传标记的扩增是环境DNA技术的关键环节，因此本文仅就这两个部分工作进行了探讨。

材料与试剂

1. 一次性口罩 (biosharp^® Life sciences, catalog number: BC019)
2. 一次性橡胶手套 (biosharp^® Life sciences, catalog number: BS-ST-003)
3. 0.45 μm孔径的混合纤维素滤膜 (MCE, Whatman, catalog number: 7141-104)
4. 400目孔径的尼龙纱布 (重庆永捷实验仪器有限公司)
5. 5 ml容量的冻存管 (biosharp^® Life sciences, catalog number: BS-50-ST)
6. PCR用八连管 (biosharp^® Life sciences, catalog number: BS-0208-T)
7. PCR用八连盖 (biosharp^® Life sciences, catalog number: BS-0208-C)
8. 记号笔
9. 冰袋
10. 超纯水
11. 无水乙醇 (重庆川东化工集团有限公司)
    
12. 强力水样DNA提取试剂盒 (PowerWater DNA Isolation Kit, QIAGEN, catalog number: 14900-100-NF)
13. 引物
14. DNA模板
15. 1.1x 浓度的PCR预混液 (1.1x T3 Super PCR Mix, TSINGKE, catalog number: TSE030)
16. 灭菌双蒸水
17. 琼脂糖 (REGULAR AGAROSE G-10, BIOWEST, catalog number: 9012-36-6)
18. 核酸染料 (SYBR^® Safe DNA凝胶染料，ThermoFisher, catalog number: S33102)
19. DNA marker (50bp DNA Ladder, Solarbio, catalog number: M1800)
20. DNA胶回收试剂盒 (AxyPrep DNA Gel Extraction Kit, Axygen, catalog number: AP-GX-50G)
21. 10%浓度的商业漂白水 (见溶液配方)
22. Longmire’s lysis buffer (见溶液配方)
23. 1x TAE缓冲液 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 1 L容量的塑料瓶
2. 塑料水桶
3. 不锈钢或塑料漏斗
4. 塑料密封箱
5. 灭菌镊子
6. 有机玻璃或不锈钢采水器 (重庆永捷实验仪器有限公司，1,000 ml)
7. 便携式超声波测深仪 (美国SpeedTech, model: SM-5A)
8. 砂芯过滤装置 (天津津腾实验设备有限公司，model: T-50)
9. 超纯水系统 (Millipore, model: Direct-Q 5UV)
10. 普通冰箱 (青岛海尔股份有限公司，model: BCD-451WDIYU1)
11. 低温冰箱 (青岛海尔特种电冰柜有限公司，model: BC/BD-518HD)
12. 紫外灯 (苏州市相城区创新照明电器厂，品牌：虎丘，model: ZWS)
13. 真空泵 (天津华鑫仪器有限公司，model: HX-01)
14. 恒温水浴锅 (上海齐欣科学仪器有限公司，model: DK-8D)
15. 涡旋仪 (配备5 ml适配器；SCILOGEX, model: MX-S)
16. 微量离心机 (配备2 ml转头；Thermo Scientific, model: Sorvall Legend Micro 17)
17. 各种规格移液枪 (配备各种型号枪头；Eppendorf, model: Research plus)
18. 小型离心机 (Kylin-Bell, model: LX-200)
19. 梯度PCR仪 (ABI, model: Veriti)
20. 电泳设备 (Bio-Rad, model: PowerPac Universal)
21. 制胶槽 (配备梳子)
22. 紫外凝胶成像系统 (Bio-Rad, model: Gel Doc XR)
23. 核酸蛋白分析仪 (Thermo Scientific, model: NanoDrop 2000)
    

实验步骤

一、水体环境DNA的获取

1. 水体环境DNA的采集
   1.1

   水样采集

   1)

   采样点的设置
   根据水体流域大小与监测目的，设置若干采样点。设置越多采样点，则能提高物种检出率。其中可包含传统监测的历史采样点，用以比较环境DNA方法与传统方法监测结果的异同 (比如Goutte et al., 2020)。
   

   2)

   采样体积的选择
   已发表的鱼类环境DNA研究根据不同的研究水体与研究目的所选择的采样体积为每份1.5 ml-45 L不等，其中每份水样采集1 L或2 L是野外采样常用的标准 (详情见Shu et al., 2020综述附件Table S2)。野外采样体积的选择需要考虑水样采集与过滤的效率，建议读者通过增加重复样品数量或重复采样次数来提高环境DNA检测率 (Shu et al., 2020)。这里推荐读者每份水样采集1 L，每次采集至少3个重复样品。
   

   3)

   水样采集 (以湖泊为例，图1；舒璐等，2020)
   使用采水器取水，先根据实际水深(水深由便携式超声波测深仪测定)分别取上、中、下层水样各1 L，然后倒入水桶中混合，最后从中取混合水样1 L保存至1 L塑料瓶中。塑料瓶需要提前被消毒灭菌：使用10%浓度的商业漂白水浸泡10 min，并用自来水漂洗3遍。采水器和其他工具 (如：水桶、漏斗) 被采样点的水润洗两次以后再取水。岸边采样可以选择在桥梁、突出平台等便于操作的地点采集水样。湖内采样可乘船前往既定地点采样。
           每个采样点采集3个重复样品。采集的水样应放置于装有冰袋的密封箱中，避光低温保存，尽快运送回实验室，进行下一个步骤的处理。
   
   
   图1. 湖泊水样采集 (摄于云南洱海，2019年秋季). A. 在岸边使用采水器采水；B. 乘坐快艇至湖心使用采水器采水；C. 将不同水层水样倒入水桶混合后，再将1 L混合水样装入采样瓶。
   
   

   4)

   设置野外采样的阴性对照
   将装有1 L超纯水的塑料瓶带至每一个采样点，在采样时将其盖子打开，采样结束后再将盖子关上。以此监测采样过程中样品是否被外源DNA污染。
   

   5)

   采样中的注意事项
   采样过程中，采样人员需佩戴一次性口罩和一次性橡胶手套，并于每个采样点更换新的口罩和手套，以避免不同采样点水样的交叉污染。采样时应注意不要将底层泥沙带起，搅浑水样。润洗过采样设备的废水应倾倒在流域的下游，以防止污染该点样品。
   

   本节仅描述了淡水湖泊水样采集的细节，有关其他类型水域（如溪流、江河和海湾等）的水样采集方案在“Environmental DNA Sampling and Experiment Manual”手册 (http://ednasociety.org/en/manual；Minamoto et al., 2020) 中有详细阐述。
   
   1.2

   水样过滤
   建议读者在24 h之内尽快过滤水样，等待过滤的水样可先4 °C冷藏保存。若水样需要被保存更长的时间 (建议不超过一周)，则需立即于冰箱-20 °C冷冻保存或添加试剂 (无水乙醇或Longmire’s lysis buffer) 常温保存。试剂添加要求无水乙醇与水样的体积比例为2:1；Longmire’s lysis buffer与水样的体积比例为1:3，因此该方式更适用小体积 (如15 ml) 的水样保存 (Kumar et al., 2019)。

   1)

   过滤前需对过滤设备和操作台面进行消毒，以防外源DNA的污染 (Pedersen et al., 2015)：

   a)

   使用10%浓度的商业漂白水浸泡砂芯过滤装置各部件 (包括防尘盖、过滤杯、接收瓶、砂芯滤器、铝合金夹) 10 min，并用自来水漂洗3遍、超纯水润洗1遍。每份样品过滤完毕后重复该操作。

   b)

   使用10%浓度的商业漂白水对真空泵的表面和实验室的操作台面进行擦拭，再用紫外灯照射30 min。

   2)

   组装砂芯过滤装置，连接真空泵。使用灭菌镊子夹取一张孔径为0.45 μm的混合纤维素滤膜放置在砂芯滤器上 (图2)。该滤膜是水生生物环境DNA采集中常用的滤膜类型之一 (Tsuji et al., 2019; Shu et al., 2020)。
   
   
   图2. 连接真空泵的砂芯过滤装置 A. 连接真空泵的砂芯过滤装置正面；B. 连接真空泵的砂芯过滤装置侧面；C. 将滤膜放置在砂芯滤器上。
   
   

   3)

   将水样倒入过滤装置的300 ml过滤杯中，启动真空泵。待漏斗中水样过滤完毕，先关闭真空泵，再倒入剩余水样。一份1 L水样，通常要分4次才能过滤完。若滤膜出现堵塞情况，则需更换新的滤膜，再将剩余水样过滤完毕。

   4)

   若采集的水样较为浑浊、杂质较多，可先使用孔径为400目 (约37 μm) 的尼龙纱布对水样进行预过滤处理，再使用孔径为0.45 μm的混合纤维素滤膜对预过滤后的水样进行真空抽滤 (比如Turner et al., 2014; Li et al., 2018)。若滤膜仍然出现堵塞情况，则需更换新的滤膜，再将剩余水样过滤完毕。

   5)

   为评估过滤时是否存在外源DNA污染, 每份样品过滤前，先过滤1 L超纯水，然后收集该滤膜作为过滤时的阴性对照。

   6)

   收集滤膜时，使用灭菌镊子从边缘夹起滤膜，将滤膜上面朝内卷成圆筒状 (不要卷太紧或折叠滤膜)，放置于5 ml的冻存管中。推荐读者立即将其放入-20 °C冰箱冷冻保存，等待DNA的提取。若在野外不具备冷冻保存的条件，读者也可添加无水乙醇或Longmire’s lysis buffer于冻存管中，将滤膜常温保存 (Kumar et al., 2019)。
   
   
   图3. 收集滤膜 A-D. 使用灭菌镊子从边缘夹起滤膜，将滤膜上面朝内卷成圆筒状 (勿卷太紧或折叠滤膜)，放置于5 ml的冻存管中。
   
   
2. 水体环境DNA的提取
   参照强力水样DNA提取试剂盒 (PowerWater DNA Isolation Kit) 的说明书提取滤膜DNA。该试剂盒是水生生物环境DNA提取中常用的商业试剂盒之一 (Tsuji et al., 2019; Shu et al., 2020)。
   注：若一份样品产生多张滤膜，则需重复说明书中的前4个步骤，直至该样品的滤膜全部在一个PowerWater^® Bead Tube中被研磨完毕，再进行后续的操作。为评估提取时是否存在外源DNA污染，每批样品进行环境DNA提取时应包含一个空白滤膜作为提取时的阴性对照。
   

二、鱼类遗传标记的扩增

1. 遗传标记和引物的选择
   这里推荐两对鱼类环境DNA宏条形码引物：MiFish-U (Miya et al., 2015) 和Tele02 (Taberlet et al., 2018) 引物。两对引物均被设计用于扩增线粒体12S rRNA基因的高变异区域, 扩增长度分别为163-185 bp和129-209 bp。MiFish-U引物是鱼类环境DNA宏条形码分析的常用引物，Tele02引物是基于MiFish-U引物的优化版本。Tele02引物与MiFish-U引物的扩增区域非常接近，但Tele02引物的扩增片段具有更高的类群分辨率。建议读者根据预实验的扩增与测序结果选择表现最优的引物。
   
2. PCR反应
   使用1.1x浓度的PCR预混液 (1.1x T3 Super PCR Mix) 进行PCR扩增。使用时只需添加模板、引物，即可进行PCR扩增，反应完成后可直接用于电泳上样。
   2.1

   PCR反应体系：严格按照1.1x T3 Super PCR Mix说明书配比。推荐25 μl PCR反应体系(表1)。
   
   表1. 25 μl PCR反应体系.
   
   
   
   2.2

   PCR反应程序：严格按照1.1x T3 Super PCR Mix说明书在PCR仪上设置PCR反应程序(表2)。
   
   表2. PCR反应程序.
   
   注意：MiFish-U引物的退火温度为60 °C；Tele02引物的退火温度为55 °C。延伸时间依据PCR产物长度而定，不足1 kb的按1 kb计算。
   
   
   2.3

   设置PCR阴性对照：每次PCR反应使用1 μl灭菌双蒸水为模板作为PCR阴性对照。
   2.4

   PCR重复：为减少PCR扩增偏倚，每份样品 (包括环境DNA样品以及采样、过滤、DNA提取和PCR扩增设置的阴性对照) 重复扩增三次, 将同一样品的PCR产物等体积混合后用于下游实验 (Ficetola et al., 2015)。
3. 琼脂糖凝胶电泳检测
   3.1

   使用2% 的TAE琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳检测，选用50 bp DNA Ladder作为DNA marker。
   3.2

   使用凝胶成像系统观察电泳条带。将所有产生目的片段条带的样品用于后续建库和测序。未产生目的片段条带的样品不参与后续建库和测序。若所有阴性对照均无目的条带, 则表明从采样、过滤、DNA提取至PCR扩增均无外源鱼类DNA污染 (比如Berger et al., 2020; Zou et al., 2020)。
4. 目的条带回收纯化
   参照DNA胶回收试剂盒 (AxyPrep DNA Gel Extraction Kit) 的说明书回收纯化目的基因片段，并用NanoDrop 2000测定浓度。
   
5. 建库与测序
   纯化产物送至生物技术公司，通过测序服务来完成样品测序工作。每个样品的PCR产物单独建库, 然后使用Illumina NovaSeq 6000测序平台进行第二代高通量测序。
   

注意事项

由于环境DNA技术的高灵敏性，实验操作中任何环节的疏漏均易造成外源DNA的污染，通过严格管理和把控各环节潜在的污染，有利于增强环境DNA检测结果的可信度 (Shu et al., 2020)：

1. 必须严格按照步骤要求处理采样设备、过滤设备和实验操作台面，以避免外源DNA的污染。
2. 必须严格设置阴性对照检测实验过程各环节是否受到污染。所有阴性对照均需参与全部实验流程，产生目的片段条带的阴性对照将参与后续建库和测序，通过分析阴性对照的测序结果评估污染情况。
3. 建议水样过滤、环境DNA提取、PCR加样与PCR扩增分别在单独的房间完成，且不要在同一天同时进行这些操作，以避免样品间交叉污染以及外源DNA污染。
4. 为避免污染，建议将不同操作步骤需要的试剂或材料保存于不同的冰箱或储存柜。试剂尽量分装，以免污染而造成大的浪费。
   

溶液配方

1. 10%浓度的商业漂白水
   将蓝月亮^®漂白水与自来水按1:9配比混合。漂白水稀释液用于清除采样瓶、实验台面以及样品与设备接触面的DNA残留，确保实验操作过程中样品不被外源DNA污染 (Deiner et al., 2015)。
   
2. 1x TAE缓冲液
   将一份(约7.0 g)TAE速溶颗粒 (MonTrack^TM TAE，Monad，catalog number: CR00101S) 溶于1 L超纯水中，混匀溶解，室温放置备用。
   
3. Longmire’s lysis buffer，以配制1 L溶液为例：
   先后称量12.11 g Tris (100 mM)、29.22 g EDTA (100 mM)、0.58g NaCl (10 mM)、5 g SDS (0.5%)、2 g NaN₃ (0.2%)，再加超纯水定容至1 L，室温放置备用。
   

致谢

我们的研究受到国家重点研发计划项目 (2018YFD0900805) 和国家自然科学基金项目 (31872204) 资助。

竞争性利益声明

作者声明没有利益冲突。

参考文献

1. 舒璐，林佳艳，徐源，曹特，封吉猛，彭作刚. (2020). 基于环境DNA宏条形码的洱海鱼类多样性研究. 水生生物学报 44(5): 1080-1086.
2. Barnes, M. A. and Turner, C. R. (2015). The ecology of environmental DNA and implications for conservation genetics. Conservation Genetics 17: 1-17.
3. Balasingham, K. D., Walter, R. P., Mandrak, N. E. and Heath, D. D. (2018). Environmental DNA detection of rare and invasive fish species in two Great Lakes tributaries. Mol Ecol 27(1): 112-127.
4. Berger, C. S., Hernandez, C., Laporte, M., Côté, G., Paradis, Y., Kameni T., D. W., Normandeau, E. and Bernatchez, L. (2020). Fine-scale environmental heterogeneity shapes fluvial fish communities as revealed by eDNA metabarcoding. Environmental DNA 1-20.
5. Cristescu, M. E. and Hebert, P. D. N. (2018). Uses and Misuses of Environmental DNA in Biodiversity Science and Conservation. Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics 49: 209-230.
6. Deiner, K., Walser, J. -C., Mächler, E. and Altermatt, F. (2015). Choice of capture and extraction methods affect detection of freshwater biodiversity from environmental DNA. Biological Conservation 183: 53-63.
7. Evans, N.T., Li, Y., Renshaw, M. A., Olds, B. P., Deiner, K., Turner, C. R., Jerde, C. L., Lodge, D. M., Lamberti, G. A. and Pfrender, M. E. (2017). Fish community assessment with eDNA metabarcoding: Effects of sampling design and bioinformatic filtering. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences, 74: 1362-1374.
8. Ficetola, G. F., Pansu, J., Bonin, A., Coissac, E., Giguet‐Covex, C., De Barba, M., Gielly, L., Lopes, C. M., Boyer, F., Pompanon, F., et al. (2015). Replication levels, false presences and the estimation of the presence/absence from eDNA metabarcoding data. Mol Ecol Resour 15: 543-556.
9. Griffiths, N. P., Bolland, J. D., Wright, R. M., Murphy, L. A., Donnelly, R. K., Watson, H. V. and Hanfling, B. (2020). Environmental DNA metabarcoding provides enhanced detection of the European eel Anguilla anguilla and fish community structure in pumped river catchments. J Fish Biol 97(5): 1375-1384.
10. Goutte, A., Molbert, N., Guerin, S., Richoux, R. and Rocher, V. (2020). Monitoring freshwater fish communities in large rivers using environmental DNA metabarcoding and a long-term electrofishing survey. J Fish Biol 97: 444-452.
11. Keskin, E., Unal, E. M. and Atar, H. H. (2016). Detection of rare and invasive freshwater fish species using eDNA pyrosequencing: Lake Iznik ichthyofauna revised. Biochemical Systematics and Ecology 67: 29-36.
12. Kumar, G., Eble, J. E. and Gaither, M. R. (2019). A practical guide to sample preservation and pre-PCR processing of aquatic environmental DNA. Mol Ecol Resour 1-11.
13. Li, J., Handley, L. L., Read, D. S. and Hanfling, B. (2018). The effect of filtration method on the efficiency of environmental DNA capture and quantification via metabarcoding. Mol Ecol Resour 18: 1102-1114.
14. Li, J., Hatton-Ellis, T. W., Handley, L. L., Kimbell, H. S., Benucci, M., Peirson, G. and Haenfling, B. (2018). Development of an environmental DNA method for monitoring fish communities: ground truthing in diverse lakes with characterised fish faunas. bioRxiv e394718.
15. Miya, M., Sato, Y., Fukunaga, T., Sado, T., Poulsen, J. Y., Sato, K., Minamoto, T., Yamamoto, S., Yamanaka, H., Araki, H., et al. (2015). MiFish, a set of universal PCR primers for metabarcoding environmental DNA from fishes: detection of more than 230 subtropical marine species. Roy Soc Open Sci 2: 150088.
16. Minamoto, T., Miya, M., Sado, T., Seino, S., Doi, H., Kondoh, M., Nakamura, K., Takahara, T., Yamamoto, S., Yamanaka, H., et al. (2020). An illustrated manual for environmental DNA research: water sampling guidelines and experimental protocols. Environmental DNA 3: 8-13.
17. Pedersen, M. W., Overballe‐Petersen, S., Ermini, L., Sarkissian, C. D., Haile, J., Hellstrom, M.,Spens, J., Thomsen, P. F., Bohmann, K., Cappellini, E., et al. (2015). Ancient and modern environmental DNA. Philos T R Soc B 370: 20130383.
18. Sigsgaard, E. E., Nielsen, I. B., Carl, H., Krag, M. A., Knudsen, S. W., Xing, Y., Holm-Hansen, T. H., Moller, P. R. and Thomsen, P. F. (2017). Seawater environmental DNA reflects seasonality of a coastal fish community. Marine Biology 164: 128.
19. Shu, L., Ludwig, A. and Peng, Z. (2020). Standards for methods utilizing environmental DNA for detection of fish species. Genes 11: 296.
20. Turner, C. R., Barnes, M. A., Xu, C. C. Y., Jones, S. E., Jerde, C. L. and Lodge, D. M. (2014). Particle size distribution and optimal capture of aqueous macrobial eDNA. Methods Ecol Evol 5: 676-684.
21. Taberlet, P., Bonin, A., Coissac, E. and Zinger, L. (2018). Environmental DNA: For Biodiversity Research and Monitoring. Oxford University Press. ISBN: 978019876 7282
22. Tsuji, S., Takahara, T., Doi, H., Shibata, N. and Yamanaka, H. (2019). The detection of aquatic macroorganisms using environmental DNA analysis—a review of methods for collection, extraction, and detection. Environmental DNA 1: 99-108.
23. Ushio, M., Murakami, H., Masuda, R., Sado, T., Miya, M., Sakurai, S., Yamanaka, H., Minamoto, T. and Kondoh, M. (2018). Quantitative monitoring of multispecies fish environmental DNA using high-throughput sequencing. Metabarcoding and Metagenomics 2: 1-15.
24. Zou, K., Chen, J., Ruan, H., Li, Z., Guo, W., Li, M. and Liu, L. (2020). eDNA metabarcoding as a promising conservation tool for monitoring fish diversity in a coastal wetland of the Pearl River Estuary compared to bottom trawling. Sci Total Environ 702: e134704.