结扎公鼠和假孕母鼠的制备

材料与试剂

材料

1. 手术剪（上海金钟，J21010）
2. 弯头镊(上海金钟，J40120)
3. 尖头镊（上海金钟，J40120）
4. 酒精灯
5. 注射器
6. 缝合线

1. 2,2,2-Tribromoethanol（SIGMA-ALDRICH, catalog number: T48402）
2. 2-Methyl-2-butanol（SIGMA, catalog number: 240486）
3. ULTRA PURE WATER（MILLIPORE, catalog number: TMS-006-A）
4. 2.5%阿佛丁麻醉剂（见溶液配方）

仪器设备

1. 超净工作台(苏净安泰，型号: HS-840-U)
2. 恒温加热台(深圳鑫诚，型号:JR-100)
3. 电子天平(Sartorius, 型号: MSA125P-CE)
   

实验步骤

1. 结扎公鼠的制备（见图1）：
   
   
   图1：雄鼠结扎手术。② *示睾丸，#示脂肪垫；③箭头所示为输精管断端
   
   
   1.1

   根据实验需要准备6-8周龄的ICR公鼠若干只。
   1.2

   鼠抓取保定，用2.5%麻醉剂以0.02ml/g腹腔注射，静候几分钟，等小鼠完全麻醉后腹部朝上固定在小鼠操作热台上。
   1.3

   在腹部靠下位置（睾丸上侧）备皮：剪去被毛，擦拭酒精。用剪刀沿着腹中线将皮肤剪开1厘米长切口，取无尘纸擦干净血迹后，再沿腹白线切口钝性分离腹部肌肉，打开腹膜腔。
   1.4

   先用弯头镊夹持并牵引出左侧睾丸及脂肪垫（见图1），找到输精管后用尖头镊将输精管挑出撑开约10毫米。将弯头镊置于酒精灯外焰灼烧几秒后，慢慢轻夹住输精管，输精管迅即被烫至扁白状态，距离第一烫断点3-5毫米处，再次制造一个烫断点，用手术剪将两烫断点中间的输精管去除，注意观察并确保输精管断口处还留有一小截的扁白段，随后用弯头镊将睾丸及脂肪垫小心送还腹腔。
   1.5

   右侧做同样操作。
   1.6

   术部缝合，通常肌肉缝一针，皮肤缝三针，整理手术切口，喷涂酒精后，将动物置于热台上观察约10-15分钟至苏醒后，返回饲养间。
   1.7

   小鼠结扎手术后需恢复14天，并进行为期1周的试配种实验。在1周内，连续用结扎公鼠与母鼠配种，观察所有见栓母鼠的妊娠情况，确定所有见栓母鼠都不会妊娠，这样的结扎公鼠方可用于正式实验。
   1.8

   结扎公鼠每天都可交配，但最好是每隔一天交配一次。结扎公鼠必须建立交配及检栓记录，根据我们的经验，结扎公鼠可维持高见栓率长达1年以上，对连续4~6次未让交配母鼠见栓的结扎公鼠应淘汰。
   
   
2. 假孕母鼠的制备（见图2）：
   
   
   图2：发情及交配小鼠的辨别. 左图：发情间期外生殖器不肿、不红、干燥、不皱。中图：发情期间外生殖器微肿、粉红、湿润、起皱。右图：阴道口精液凝固后形成的淡黄色块状阴道栓。
   
   
   2.1

   备6周龄-2月龄以上的ICR母鼠若干作为受体群。受体群的母鼠数量是根据实验需求来确定的。
   2.2

   从受体群中查出发情的母鼠，发情的判断标准是母鼠阴道口红润、肿胀。母鼠一般每隔4~5天发情和排卵一次，因此，在一个随机发情的母鼠群内总是有20%~25%的母鼠处于发情期。按照这个比例，如果要检获得10~15只发情母鼠，必须检查大约50~75只母鼠。
   2.3

   将查出的发情母鼠以1:1或者2:1的比率投入至结扎公鼠笼内进行交配。如果能正确地选择处于发情期的母鼠用于交配，1:1合笼的见栓率应该在50%以上。由于有时不能确认母鼠是否是发情，采用雌雄2:1合笼的方法可增加见栓母鼠的数量。如果结扎公鼠数量有限，采用雌雄2:1合笼的方法可以使每只公鼠的配种效率增加。反之，如果发情母鼠的数量有限，1:1合笼能获得最高的见栓率。
   2.4

   交配成功的母鼠，阴道口将会有黄白色块状阴道栓生成。通常在第一天下午4点-6点合笼，第二天上午7点至9点查栓，有阴道栓的小鼠即是假孕状态0.5天的母鼠，可以用来进行后续的胚胎移植实验；无阴道栓的母鼠则投回受体群中，可继续用来交配制备假孕母鼠。
   2.5

   栓后0.5天的假孕母鼠用于受精卵的输卵管移植，见栓后2.5天的假孕母鼠用于胚胎的子宫移植。
   2.6

   假孕母鼠理想体重为25~35 g。体重过大的母鼠不适合于输卵管移植，因为包裹在卵巢周围的脂肪垫过大影响受精卵输送；而体重过低的母鼠妊娠率会下降。体重低的母鼠应该等到增重后再使用，体重过高的母鼠应该定期被汰。

溶液配方

1. 2.5%阿佛丁麻醉剂配制
   称取10 g 2,2,2-Tribromoethanol后加入10 ml 2-Methyl-2-butanol，240转/25 ℃避光振荡至沉淀完全消失，配制成浓储液。使用时按照2.5%浓度将浓缩液加入相应的ULTRA PURE WATER中（2.5 ml浓缩液：97.5 ml超纯水），280转/25 ℃避光振荡至沉淀完全消失，0.25 nm过滤器过滤后即为工作液。
   

致谢

本实验室的胚胎操作技术主要来源于中科院分子细胞中心李劲松研究员实验室，美国洛克菲勒大学转基因平台及美国洛克菲勒大学Peter Mombaerts实验室。特此致谢！

参考文献

1. Champlin, A. K., Dorr, D. L. and Gates, A. H. (1973). Determining the stage of the estrous cycle in the mouse by the appearance of the vagina. Biol Reprod 8(4): 491-494.
2. Whitten, W. K. and Champlin, A. K. (1978). Pheromones, estrus, ovulation and mating. In Methods in mammalian reproduction (Ed. J.C. Daniel), p 403- -417. Academic Press, NewYork.
3. Andras, N., Marina, G., Kristina, V. and Richard, B.(2003). Manipulating the Mouse Embryo. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York.