沉积物、岩石样品总DNA提取

材料与试剂

1. 2 ml、15 ml和50 ml离心管 (Axygen, catalog number: MCT-200-C; SCT-15ML-25-S; SCT-50ML-25-S)
2. 药匙 (无菌)
3. NaH₂PO₄ (Sigma, catalog number: S3139)
4. Na₂HPO₄ (Sigma, catalog number: S3264)
5. EDTA (pH = 8.0, Sigma, catalog number: 324506)
6. Tris-HCl (pH = 8.0, Solarbio, catalog number: T8230)
7. NaCl (Sigma, catalog number: S3014)
8. CTAB (Sigma, catalog number: 52365)
9. 蛋白酶K (Sigma, catalog number: 70663)
10. 溶菌酶 (Sigma, catalog number: L6876)
11. SDS (Sigma, catalog number: L3771)
12. 苯酚-氯仿-异戊醇 25:24:1 (pH > 7.8, Sigma, catalog number: 77617)
13. Polydexoyinosinic-deoxycytidylic acid (poly dI-dC) (Sigma, catalog number: P4929)
14. 异丙醇 (Sigma, catalog number: I9516)
15. 1× TE缓冲液 (pH =8.0) (生工，catalog number：B548106)
16. DNeasy^® PowerSoil^® Kit (Qiagen, catalog number: 12888-100)
17. DNA抽提缓冲液 (1L) (见溶液配方)
18. 20 % SDS (十二烷基磺酸钠) (见溶液配方)
19. 3 M醋酸钠 (pH 5.2) (见溶液配方)
20. 0.5 ug/ul Poly (dl-dC) (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 组织研磨机 (Tissuelyser-48, 上海净信公司，中国)
2. 离心机 (5810R，Eppendorf公司，德国)
3. 涡旋仪 (Vortex Genie® 2 Vortex，MO BIO公司，美国)
4. 水平24 × 1.5 ml离心管支架 (SI-H524，MO BIO公司，美国)
5. 移液枪 (10 μl, 200 μl, 1 ml, Eppendorf公司，美国)
6. 紫外交联仪 (Stratalinker 1800 UV，Stratagene公司，美国)
7. 高压蒸汽灭菌锅 (G154DWS，致微 (厦门) 仪器有限公司，中国)
8. 鼓风干燥箱 (DHG-9091A，上海一恒科学仪器有限公司，中国)
9. 马弗炉 (MFLX544-12，上海马弗炉科技仪器有限公司，中国)
10. 0.22 μm 滤膜 (SLGP033RB，Merck Millipore公司，爱尔兰)
11. 酒精喷壶
12. 冰箱 (MDF-U74V，Panasonic公司，日本)
13. Nanodrop (Nano-300，杭州奥盛仪器有限公司，中国)
14. 电磁加热搅拌器 (TH-500，上海沪西分析仪器厂，中国)
15. 耐高温磁性搅拌子
    

实验步骤

一、 沉积物样品 (Zhou et al, 1996; Natarajan et al, 2016)

1. 在2 ml Ep管中加入0.3 g粒径为0.1 mm的玻璃砂，之后加入适量沉积物 (一般0.3 g~0.5 g湿重)；
2. 加入650 μl的DNA抽提缓冲液，在打碎前需要将沉积物和缓冲液混匀，此步骤需在涡旋仪上安装水平离心管支架，将离心管放在离心管架上，一般选择5档，振荡3~5 min；
3. 将离心管放入组织研磨机中，30 Hz，打碎30 s，打碎三次，每次间歇120 s，然后加入70 μl溶菌酶 (起始浓度20 mg/ml)和20 μl蛋白酶K (起始浓度20 mg/ml)，缓慢上下颠倒几次来混匀，37 °C温育30 min，每隔10 min混匀，缓慢颠倒混匀即可，不要过度振荡；
4. 加入70 μl 20 % SDS混匀，缓慢上下颠倒几次来混匀，65 °C温育2 h，每隔30 min缓慢颠倒混匀数次；
5. 10,000 × g离心10 min，取上清液至新的2 ml Ep管中，一般转移900 μl，再加入等体积的苯酚-氯仿-异戊醇 (25:24:1)溶液，小心混匀至乳浊状，即一般振荡管子混匀3 min左右，4 °C条件下16,000 × g离心25 min；
6. 小心吸取上层水相至新的2 ml离心管中，记录体积，加入0.6体积的异丙醇，再加入0.2体积的3 M pH = 5.2醋酸钠 (终浓度为0.3 M)，颠倒混匀，放入4 °C过夜，一般6~9小时；
7. 将沉淀过夜的离心管16,000 × g离心30 min，小心吸掉上清液，注意不要碰到沉淀；
8. 小心加入70 %的冰乙醇，缓慢加入，小心晃动离心管洗涤沉淀，4 °C条件下16,000 × g离心30 min，小心吸取并弃掉上清液，不要碰到沉淀；
9. 重复步骤8一次或者两次 (可选步骤)；
10. 在超净台中打开离心管盖，室温下干燥20~30 min，注意不要干燥太久，致使DNA很难洗脱和溶解；
11. 用适量的去离子水或者1× TE溶液溶解DNA，保存在-80 °C。
12. 如果第一次提取的DNA浓度达不到后续实验要求，可以进行二次提取，再将装有沉积物的小管加入600-700 μl提取缓冲液，用力将离心后的沉积物弹起，并且混匀，这一步可以参照步骤2，沉积物和缓冲液混合均匀后，放在破碎仪上40 Hz，打碎30 s，打碎三次，每次间歇120 s，加入70 μl 20 % SDS，20 μl蛋白酶K (起始浓度20 mg/ml)，65 °C水浴2 h，每30 min混匀一次；
13. 重复步骤5-11，将两次提取的DNA混合；
14. 按照步骤6-11重新沉淀和纯化DNA；
15. 将浓缩纯化后的DNA分装，并保存在-80 °C。
    

二、 岩石样品 (Zhang et al, 2016)

1. 实验中要用的铁勺、研钵和玻璃器皿需要用去离子水冲洗2-3次，用铝箔纸包好，在烘箱中烘干，然后放入马弗炉160 °C高温灭菌6小时，待温度降至室温后使用；
2. 主要使用DNeasy^® PowerSoil^® Kit提取DNA，对其中有些步骤进行优化。在加入60 μl C1溶液后，向管中加入5 μg用UV照射处理过的Poly (dI-dC) (Sigma-Aldrich，USA)，取0.5 g研磨粉碎的岩石样品，在组织研磨机中破碎30 s，频率为70 Hz，打碎三次，每次间歇120 s；
3. 在室温下，10,000 × g离心1 min，小心将500 μl上清转移至新的2 ml离心管中；
4. 加入250 μl C2溶液，震荡5 s，4 °C孵育5 min；
5. 在室温下，10,000 × g离心1 min，小心将600 μl上清转移至新的2 ml离心管中；
6. 加入200 μl C3溶液，震荡5 s，4 °C孵育5 min；
7. 在室温下，10,000 × g离心1 min，小心将750 μl上清转移至新的2 ml离心管中；
8. 使用前将C4溶液混合均匀，加入大约1,200 μl C4溶液，震荡5 s；
9. 吸取675 μl混合液转移至MB Spin Column中，在室温条件下，10,000 × g离心1 min；将过滤后的液体丢弃。重复此步骤，直至混合液体全部过滤完；
10. 加入500 μl C5溶液，室温下10,000 × g离心1 min，将过滤后的液体丢弃；
11. 继续在室温条件下，10,000 × g离心1 min；
12. 将spin filter转移至新的2 ml离心管中，转移过程中要小心，不要沾到C5溶液；
13. 向spin filter的膜中心中加入50-60 μl C6溶液，放置在室温2~5 min，然后10,000 × g离心1 min；
14. 丢弃spin filter，将2 ml离心管中的DNA溶液分装，并保存在-80 °C。
    注：C1-C6溶液为DNeasy® PowerSoil® Kit中试剂。C1溶液有助于细胞裂解的试剂组分；C2和C3溶液的作用是去除样本中的有机物 (腐殖质、细胞碎片、蛋白等)；C4溶液是高浓度盐溶液，调整DNA溶液中盐离子浓度，使得DNA可以和MB Spin Column的硅胶柱紧密结合；C5溶液中主要成分为乙醇，可以将盐离子和腐殖酸等物质从MB Spin Column的硅胶柱上洗脱掉；C6溶液为无DNA、低浓度TE缓冲溶液，主要作用是将DNA从MB Spin Column的硅胶柱上洗脱下来，溶解DNA。
    

溶液配方

一、 DNA抽提缓冲液 (1 L)

1. 1 M NaH₂PO₄
   12 g NaH₂PO₄，用去离子水定容至100 ml，0.22 μm滤膜过滤
2. 1 M Na₂HPO₄
   14.2 g Na₂HPO₄，用去离子水定容至100 ml，0.22 μm滤膜过滤
3. 0.5 M EDTA (pH 8.0)
   9.3 g EDTA (二水合乙二胺四乙酸二钠) 加50 ml去离子水 (加热和少量NaOH溶解)，之后使用NaOH调节溶液pH至8.0
4. 1 M Tris-HCl (pH 8.0)
   6.1 g Tris-base，加入50 ml水，加入HCl调节pH至8.0
5. 5 M NaCl
   146.1 g NaCl，用去离子水定容至500 ml
6. 10 % CTAB
   10 g CTAB用去离子水定容至100 ml
7. DNA提取缓冲液成分
   200 ml 0.5 M EDTA (pH 8.0)，100 ml 1 M Tris-HCl (pH 8.0)，300 ml 5 M NaCl，100 ml 10 % CTAB，用0.22 μm过滤，然后121 °C高压灭菌20 min，待溶液降至50 °C左右，加入6.8 ml 1 M NaH₂PO₄和93.2 ml 1 M Na₂HPO₄，用无菌去离子水定容至1 L。(各试剂的终浓度: 0.1 M NaH₂PO₄, 0.1 M Na₂HPO₄, 0.1 M EDTA, 0.1 M Tris-HCl, 1.5 M NaCl, 1 % CTAB)
   

二、 20 % SDS (十二烷基磺酸钠)
20 g SDS (十二烷基硫酸钠) 用去离子水定容至100 ml (可能需要加热促进溶解)

三、 3 M醋酸钠 (pH 5.2)
12.3 g醋酸钠加入40 ml去离子水，加入醋酸 (大约10 ml) 调节pH至5.2，用0.22 μm滤膜过滤，保存在4 °C

四、 0.5 μg/μl Poly (dI-dC)
称取500 μg Poly (dI-dC)，加入到1 ml无菌去离子水中混合均匀，放置在紫外交联仪 (Stratalinker 1800 UV；紫外光功率密度为5000 μJ·cm^-2)中处理5-10 min，然后保存在-20 °C (Barton et al, 2006)

注意事项

1. 用70 %乙醇洗DNA时，要小心加入或者吸取乙醇溶液，切勿使DNA沉淀脱离离心管壁造成DNA损失。
2. 运用DNeasy^® PowerSoil^® Kit提取DNA时，MB Spin Column离心后不要接触到C5溶液，C5溶液中含有乙醇。如果最后的DNA洗脱液中含有C5溶液，会影响DNA的后续实验操作。
   

致谢

沉积物样品中DNA提取实验方案改编自Natarajan Vengadesh Perumal博士发表的论文《A Modified SDS-Based DNA Extraction Method for High Quality Environmental DNA from Seafloor Environments》，岩石样品中DNA的提取方法改编自张新旭博士发表的论文《Diversity and Metabolic Potentials of Subsurface Crustal Microorganisms from the Western Flank of the Mid-Atlantic Ridge》，在此致谢Natarajan Vengadesh Perumal博士和张新旭博士。

参考文献

1. Barton, H. A., Taylor, N. M., Lubbers, B. R. and Pemberton, A. C. (2006). DNA extraction from low-biomass carbonate rock: an improved method with reduced contamination and the low-biomass contaminant database. J Microbiol Methods 66(1): 21-31.
2. Natarajan, V. P., Zhang, X., Morono, Y., Inagaki, F. and Wang, F. (2016). A Modified SDS-Based DNA Extraction Method for High Quality Environmental DNA from Seafloor Environments. Front Microbiol 7: 986.
3. Zhang, X., Feng, X. and Wang, F. (2016). Diversity and Metabolic Potentials of Subsurface Crustal Microorganisms from the Western Flank of the Mid-Atlantic Ridge. Front Microbiol 7: 363.
4. Zhou, J., Bruns, M. A. and Tiedje, J. M. (1996). DNA recovery from soils of diverse composition. Appl Environ Microbiol 62(2): 316-322.