实验原理:水稻叶绿体是水稻光合作用和多种激素合成的场所,很多核编码蛋白及叶绿体编码蛋白在叶绿体中发挥重要功能。水稻叶绿体蛋白的分离需先用机械研磨叶片,进行percoll密度梯度离心,以分离出完整未破损叶绿体,再用细胞裂解液将叶绿体裂解,分离出叶绿体蛋白。
实验目的:分离叶绿体蛋白,研究蛋白的定位、功能及质核信号的传导。
关键词: 水稻, 叶绿体蛋白, 分离检测
材料与试剂
- 75目细胞筛
- 50 ml圆底离心管
- 各种型号枪头
- 水稻叶片
- 液氮
- Sorbitol (Biotech, catalog number: S0691)
- Tricine (Sigma, catalog number: T0377)
- DTT (Sigma, catalog number: 43815)
- EDTA (Sigma, catalog number: E6758)
- MgCl2 (Sigma, catalog number: M9272)
- BSA (Roche, catalog number: BP0045)
- Lysis buffer (pH 7.85)
- Tricine
- Glycerol (国药,catalog number: 1001618)
- PMSF (Sigma, catalog number: P7626)
- Percoll (GE, catalog number: 17-0891-09)
- Cysis buffer
- 5x Sample buffer
- 2.5x CIB (chloroplasts isolation buffer), pH 7.85 (见溶液配方)
- Lysis buffer, pH 7.85 (Completely Soluble Mixture of Chloroplast Components) (见溶液配方)
- 40% percoll (见溶液配方)
仪器设备
- 研钵
- 天平
- 高速离心机
- 量筒
- 水浴锅
- 电泳仪
- 移液枪
- Western blot装置 (Mini-PROTEAN from Bio-Rad, catalog number: 164-8003)
实验步骤
- 清晨时液氮取样约3 g,磨样不要磨太碎,加1x CIB 15 ml。
- 轻摇几次后立即用75目筛子过滤至新的50 ml管子。
- 4 °C 200 x g洗涤离心3 min,下面会出现白色沉淀 (淀粉等杂质),把上清绿色部分移至一新50 ml离心管内,1,000 x g洗涤离心7 min,收集沉淀部分 (分离叶绿体在绿色沉淀部分,弃上清,因上清中是少量破碎叶绿体)。
- 用1 ml 1x CIB轻轻地把叶绿体打散 (最好用手指轻弹),移至一新的2 ml管内。
- 在2 ml管内配制1.5 ml 40% percoll (每个样分至2个管内)。把步骤4的叶绿体悬浮液轻轻摇散,加至2 ml管内在上部,此时勿摇动。
- 4 °C 1,700 x g离心6 min后破碎叶绿体形成一条带在percoll的上层,完整的叶绿体在40% percoll的底部。
- 轻轻移出上层percoll液体,用1x CIB (without BSA) 1-2 ml重悬叶绿体后4 °C 1,700 x g 离心3 min (洗去percoll) 后弃上清,用两倍沉淀体积Cysis buffer,打散后冰上30 min,利用离子渗透压的不同使叶绿体裂解开来,加5x Sample buffer,(每5 μl溶解液中加1 μl蛋白Sample buffer)。
- 100 °C,高温裂解5 min。12,000 rpm离心10 min后取上清点样。
- 制12% PAGE胶,点样每孔10 μl,70 V电泳20 min,110 V电泳约1.5 h后转膜做Western blot,操作方法见Western blot (宗伟等,2018)。
注意事项
- 清晨取样,淀粉含量较少,方便叶绿体分离。
- 所有步骤应在冰盒上,且弱光进行。
- 在转移叶绿体时,移液器枪头应剪宽使用。
溶液配方
- 2.5x CIB (chloroplasts isolation buffer), pH 7.85 (200 ml)
1.25 M Sorbitol (Biotech)
| 45.4 g
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125 mM Tricine (Sigma)
| 4.48 g
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2.5 mM DTT (Sigma)
| 0.077 g
|
2.5 mM EDTA (Sigma)
| 0.146 g
|
2.5 mM MgCl2 (Sigma)
| 5 ml (100 mM)
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2.5%(w/v) BSA (Roche)
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使用时稀释至1x CIB。BSA使用终浓度为0.1%,可配成10% BSA母液,使用时再稀释。(-20 °C存放)
- Lysis buffer, pH 7.85 (Completely Soluble Mixture of Chloroplast Components) (100 ml)
10 mM Tricine
| 0.179 g
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2 mM EDTA
| 0.0584 g
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2 mM DTT
| 100 μl (0.5 M DTT) (用前添加)
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10% (v/v) glycerol
| 10 ml (100% glycerol) (国药)
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0.0025% PMSF (Sigma)
| 用前添加
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- 40% percoll (GE) (100 ml)
40 ml percoll
20 ml ddH2O
40 ml 2.5x CIB
参考文献
- 宗伟,程赛凤,马斯琦,熊立仲. (2018). Western Blot. Bio-101 e1010130. Doi: 10.21769/BioProtoc.1010130.
Copyright: © 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:都浩, 马斯琦, 熊立仲. (2018). 水稻叶片叶绿体蛋白分离及检测.
Bio-101: e1010123. DOI:
10.21769/BioProtoc.1010123.
How to cite: Du, H., Ma, S. Q. and Xiong, L. Z. (2018). Isolation and Detection of Chloroplast Protein from Rice Leaves.
Bio-101: e1010123. DOI:
10.21769/BioProtoc.1010123.