水稻叶片叶绿体蛋白分离及检测
Isolation and Detection of Chloroplast Protein from Rice Leaves   

材料与试剂

1. 75目细胞筛
   
2. 50 ml圆底离心管
   
3. 各种型号枪头
   
4. 水稻叶片
   
5. 液氮
   
6. Sorbitol (Biotech, catalog number: S0691)
   
7. Tricine (Sigma, catalog number: T0377)
   
8. DTT (Sigma, catalog number: 43815)
   
9. EDTA (Sigma, catalog number: E6758)
   
10. MgCl₂ (Sigma, catalog number: M9272)
    
11. BSA (Roche, catalog number: BP0045)
    
12. Lysis buffer (pH 7.85)
    
13. Tricine
    
14. Glycerol (国药，catalog number: 1001618)
    
15. PMSF (Sigma, catalog number: P7626)
    
16. Percoll (GE, catalog number: 17-0891-09)
    
17. Cysis buffer
    
18. 5x Sample buffer
    
19. 2.5x CIB (chloroplasts isolation buffer), pH 7.85 (见溶液配方)
    
20. Lysis buffer, pH 7.85 (Completely Soluble Mixture of Chloroplast Components) (见溶液配方)
    
21. 40% percoll (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 研钵
   
2. 天平
   
3. 高速离心机
   
4. 量筒
   
5. 水浴锅
   
6. 电泳仪
   
7. 移液枪
   
8. Western blot装置 (Mini-PROTEAN from Bio-Rad, catalog number: 164-8003)
   

实验步骤

1. 清晨时液氮取样约3 g，磨样不要磨太碎，加1x CIB 15 ml。
   
2. 轻摇几次后立即用75目筛子过滤至新的50 ml管子。
   
3. 4 °C 200 x g洗涤离心3 min，下面会出现白色沉淀 (淀粉等杂质)，把上清绿色部分移至一新50 ml离心管内，1,000 x g洗涤离心7 min，收集沉淀部分 (分离叶绿体在绿色沉淀部分，弃上清，因上清中是少量破碎叶绿体)。
   
4. 用1 ml 1x CIB轻轻地把叶绿体打散 (最好用手指轻弹)，移至一新的2 ml管内。
   
5. 在2 ml管内配制1.5 ml 40% percoll (每个样分至2个管内)。把步骤4的叶绿体悬浮液轻轻摇散，加至2 ml管内在上部，此时勿摇动。
   
6. 4 °C 1,700 x g离心6 min后破碎叶绿体形成一条带在percoll的上层，完整的叶绿体在40% percoll的底部。
   
7. 轻轻移出上层percoll液体，用1x CIB (without BSA) 1-2 ml重悬叶绿体后4 °C 1,700 x g 离心3 min (洗去percoll) 后弃上清，用两倍沉淀体积Cysis buffer，打散后冰上30 min，利用离子渗透压的不同使叶绿体裂解开来，加5x Sample buffer，(每5 μl溶解液中加1 μl蛋白Sample buffer)。
   
8. 100 °C，高温裂解5 min。12,000 rpm离心10 min后取上清点样。
   
9. 制12% PAGE胶，点样每孔10 μl，70 V电泳20 min，110 V电泳约1.5 h后转膜做Western blot，操作方法见Western blot (宗伟等，2018)。

注意事项

1. 清晨取样，淀粉含量较少，方便叶绿体分离。
   
2. 所有步骤应在冰盒上，且弱光进行。
   
3. 在转移叶绿体时，移液器枪头应剪宽使用。
   

溶液配方

1. 2.5x CIB (chloroplasts isolation buffer), pH 7.85 (200 ml)
   

   1.25 M Sorbitol (Biotech)	45.4 g
   125 mM Tricine (Sigma)	4.48 g
   2.5 mM DTT (Sigma)	0.077 g
   2.5 mM EDTA (Sigma)	0.146 g
   2.5 mM MgCl2 (Sigma)	5 ml (100 mM)
   2.5%(w/v) BSA (Roche)

   使用时稀释至1x CIB。BSA使用终浓度为0.1%，可配成10% BSA母液，使用时再稀释。(-20 °C存放)
   
2. Lysis buffer, pH 7.85 (Completely Soluble Mixture of Chloroplast Components) (100 ml)
   

   10 mM Tricine	0.179 g
   2 mM EDTA	0.0584 g
   2 mM DTT	100 μl (0.5 M DTT) (用前添加)
   10% (v/v) glycerol	10 ml (100% glycerol) (国药)
   0.0025% PMSF (Sigma)	用前添加

3. 40% percoll (GE) (100 ml)
   40 ml percoll
   20 ml ddH₂O
   40 ml 2.5x CIB
   

参考文献

1. 宗伟，程赛凤，马斯琦，熊立仲. (2018). Western Blot. Bio-101 e1010130. Doi: 10.21769/BioProtoc.1010130.