水稻原生质体的分离及转化
Isolation and Transformation of Rice Protoplasts   

材料与试剂

1. 2 ml圆底离心管，10 ml圆底离心管
   
2. 各种型号枪头 (所有与原生质体接触的枪头都要剪去尖头)
   
3. 刀片
   
4. 锡纸
   
5. 培养皿
   
6. 150目的筛子
   
7. 中花11黄化苗
   注：将中花11种子按照组培方法于生根培养基中发芽，28 °C暗培养10-15天。少于10天的黄化苗叶鞘很短，细胞太小，不利于观察；而大于15天的黄化苗叶鞘由白色转为略带褐色，细胞太老，原生质体转化后活细胞很少。
   
8. 质粒
   注：CsCl梯度离心纯化的质粒，或者QIAGEN plasmid Midi Kit (Catalog number: 12143)纯化的质粒
   
9. KOH
   
10. Cellulose RS (Yakult Honsha)
    
11. Macerozyme (Yakult Honsha)
    
12. PEG4000 (Fluka)
    
13. BSA (Sigma)
    
14. Mannitol (Sigma)
    
15. KCl (Sangon)
    
16. CaCl₂ (BBI) 
    
17. MgCl₂ (Sigma)
    
18. NaCl (BBI) 
    
19. MES hydrate (Sigma)
    
20. 2 M Mannitol (Sigma, FW: 182.17) (见溶液配方)
    
21. 0.2 M KCl (Sangon, FW: 74.55) (见溶液配方)
    
22. 1 M CaCl₂ (BBI, FW: 147.02) (见溶液配方)
    
23. 0.5 M MgCl₂ (Sigma, FW: 95.21) (见溶液配方)
    
24. 1.54 M NaCl (BBI, FW: 58.44) (见溶液配方)
    
25. 0.1 M MES KOH, pH 5.7 (见溶液配方)
    
26. MES hydrate (Sigma, FW: 195.24) (见溶液配方)
    
27. 酶解液 (Enzyme solution) (见溶液配方)
    
28. W5 solution (见溶液配方)
    
29. MMG solution (见溶液配方)
    
30. 40% PEG 4000 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 真空泵
   
2. 摇床
   
3. 移液枪
   
4. 可调加减速度的吊篮式冷冻离心机
   
5. 计时器
   
6. Confocal显微镜
   

实验步骤

1. 配制酶解液，现配现用(见溶液配方7)，同时准备0.6 M Mannitol (溶液配方1)。
   
2. 将酶解液倒到大小合适干净的培养皿中。将暗培养10-15天的黄化苗取出，将叶鞘浸在0.6 M Mannitol中，用锋利的刀片快速切割叶鞘成1 mm以下的小段，越细越好，不要撕扯。切下的叶鞘立即转入配好的酶解液中。一般50棵黄化苗的叶鞘用10 ml酶解液酶解，可至少转化5个质粒组合。更多的转化可扩大相应反应体系。叶鞘切完毕，泡在酶解液中，抽真空5-10 min，使大部分叶鞘下沉到酶解液底部。将酶解液用锡纸包被以避光，放置在28 °C，40-50 rpm的摇床上，酶解4-5 h。酶解完成后，取一滴酶解液镜检，如果细胞圆而发亮，则健康，继续往下做；如果细胞扁且发黑，则弃去。
   
3. 酶解将近完成时，配制W5 solution及MMG solution (见溶液配方8及9)
   
4. 将酶解液混匀，用150目的筛子过滤到新的培养皿中，再转移至10 ml圆底离心管中。100 x g转速，加速、减速加速度为2，离心10 min，并预冷MMG溶液。
   
5. 用1 ml移液枪吸走上清，可见到管底有较多黄绿色沉淀，此为健康的细胞；如果沉淀很少，或者沉淀很白，则细胞质量不好。缓缓加入4 ml W5溶液，轻轻混匀，再以100 x g转速，加速、减速加速度为2，离心10 min。
   
6. 用1 ml移液枪吸走上清，缓缓加入4 ml预冷的MMG溶液，以4 °C，100 x g转速，加速、减速加速度为2，离心10 min。
   
7. 用1 ml移液枪吸走上清，缓缓加入2 ml预冷的MMG溶液，轻混匀，以4 °C，100 x g转速，加速、减速加速度为2，离心10 min。计算需要原生质体的体积：200 μl x N，再多留500 μl。用移液枪吸走上清，用所需体积的MMG溶液混匀原生质体，冰浴30 min。
   
8. 在冰浴期间准备：将需要转化的质粒稀释成20 μl，质粒的量为2-10 μg，加到2 ml圆底离心管中。将离心机转头换成2 ml的小转头，温度设定为室温。
   
9. 配制40% PEG4000溶液 (见溶液配方10)。
   
10. 将原生质体混匀，依次向2 ml离心管中 (已加入了20 μl质粒) 加入200 μl原生质体和220 μl 40% PEG4000溶液，立即轻柔上下颠倒混匀并计时。室温放置20 min。
    
11. 向2 ml离心管中加入1 ml W5溶液，混匀，室温100 x g转速，加速、减速加速度为2，离心10 min。用1 ml移液枪小心吸走上清，再加1.5 ml W5，28 °C暗培养12-16 h (不要短于8 h或者超过24 h)。
    
12. 观察前，以室温，100 x g转速，加速、减速加速度为2，离心10 min。吸走上部液体，仅留底部200 μl细胞。轻轻混匀，在Confocal显微镜下观察荧光。
    

溶液配方

1. 2 M Mannitol (Sigma, FW: 182.17)
   36.434 g加ddH₂O定容至100 ml，微波加热溶解
   
2. 0.2 M KCl (Sangon, FW: 74.55)
   1.491 g加ddH₂O定容至100 ml
   
3. 1 M CaCl₂ (BBI, FW: 147.02)
   14.7 g加ddH₂O定容至100 ml
   
4. 0.5 M MgCl₂ (Sigma, FW: 95.21)
   4.76 g加ddH₂O定容至100 ml
   
5. 1.54 M NaCl (BBI, FW: 58.44)
   8.99 g加ddH₂O定容至100 ml
   
6. 0.1 M MES KOH, pH 5.7
   称取MES hydrate (Sigma, FW: 195.24) 1.952g加ddH₂O溶解，加KOH调至pH 5.7，定容至100 ml酶解液(Enzyme solution，现用现配)
   

   Enzyme solution (终浓度)	10 ml所需母液
   0.6 M Mannitol	3 ml 2 M Mannitol
   10 mM MES (pH 5.7)	1 ml 0.1 M MES
   Cellulose RS (1.5%)	0.15 g
   Macerozyme (0.75%)	0.075 g

   搅拌溶解，55 °C加热10 min，自然冷却，再加入以下试剂
   

   0.1% BSA	0.01 g
   1 mM CaCl2	10 µl 1 M CaCl2
   ddH2O	6 ml

7. W5 solution (100 ml)*
   

   W5 solution终浓度	所需母液
   154 mM NaCl	10 ml (1.54 M NaCl)
   125 mM CaCl2	12.5 ml (1M CaCl2)
   5 mM KCl	2.5 ml (0.2 M KCl)
   2 mM MES (pH 5.7)	2 ml (0.1 M MES, pH 5.7)

   用ddH₂O定容至100 ml
   
8. MMG solution*
   

   MMG solution终浓度	100 ml所需母液
   0.6 M Mannitol	30 ml 2 M Mannitol
   15 mM MgCl2	3 ml 0.5 M MgCl2
   4 mM MES (pH 5.7)	4 ml 0.1 M MES(pH 5.7)

   用ddH₂O定容至100 ml
   *注：W5和MMG平时存放于4℃冰箱，只要没有被细菌或真菌污染，就可以继续使用。
   
9. 40 % PEG 4000溶液
   

   40% PEG终浓度	5 ml所需母液
   40 % PEG4000	2g
   0.6 M Mannitol	1.5 ml x 2 M Mannitol
   100 mM CaCl2	0.5 ml x 1 M CaCl2

   加ddH₂O至5 ml
   PEG需要用微波炉稍微加热溶解，混匀，在转化前放在37 °C温箱中保温，防止其再次凝固