实验原理:蛋白质磷酸化指的是由蛋白质激酶催化的把三磷酸腺苷(Adenosine tripHospHate, ATP)或三磷酸鸟苷(Guanosine tripHospHate, GTP)γ位的磷酸基团转移到底物蛋白质氨基酸残基(如丝氨酸、苏氨酸等)上的过程。本实验以放射性同位素标记的[γ-32P]ATP作为磷酸基团的供体,以牛髓磷脂碱性蛋白(myelin basic protein, MBP)作为蛋白质磷酸化的底物(即磷酸基团的受体),与待测蛋白质共同反应,之后通过SDS-PAGE凝胶电泳分离,用放射自显影或磷储屏检测磷酸化蛋白质,从而判断待测蛋白质是否具有磷酸化活性或自磷酸化活性。
实验目的:检测蛋白质是否具有磷酸化活性或自磷酸化活性。
关键词: 磷酸化, 激酶, 同位素, 三磷酸腺苷
材料与试剂
- 滤纸
- 保鲜膜
- 氯化镁 (Magnesium chloride, MgCl2) (Sigma, USA, catalog number: 449172)
- 氯化锰 (Manganese(II) chloride, MnCl2) (Sigma, USA, catalog number: 450995)
- 牛髓磷脂碱性蛋白 (Myelin Basic Protein bovine, MBP) (Sigma, USA, catalog number: M1891)
- 三磷酸腺苷 (Adenosine tripHospHate, ATP) (Sigma, USA, catalog number: A2383)
- β-巯基乙醇 (2-Mercaptoethanol) (Fluka, USA, catalog number: 63690)
- Tris (ANGUS chemical company, USA, catalog number: 77-86-1)
- 二硫苏糖醇 (Dithiothreitol, DTT) (上海生工,中国,catalog number: DB0058)
- 考马斯亮蓝R-250(Coomassie Brilliant Blue) (上海生工,中国,catalog number: CB0037)
- 十二烷基硫酸钠 (Sodium dodecyl sulfate, SDS) (上海生工,中国,catalog number: SB0485)
- 溴酚蓝 (BromopHenol blue) (上海生工,中国,catalog number: B0449)
- 甘氨酸 (Glycine) (上海生工,中国,catalog number: G0167)
- 盐酸 (Hydrochloric acid, HCl) (国药集团化学试剂有限公司,中国,分析纯)
- 甘油 (Glecerol) (国药集团化学试剂有限公司,中国,分析纯)
- 异丙醇 (Isopropyl alcohol) (国药集团化学试剂有限公司,中国,分析纯)
- 冰醋酸 (Acetic acid) (国药集团化学试剂有限公司,中国,分析纯)
- 95%乙醇(Ethanol) (国药集团化学试剂有限公司,中国,分析纯)
- Kinase Buffer (见溶液配方)
- 5x SDS-PAGE Loading Buffer (见溶液配方)
- 5x Tris-Glycine Buffer (见溶液配方)
- 考马斯亮蓝R-250染色液 (见溶液配方)
- 脱色液(见溶液配方)
仪器设备
- Mini-PROTEAN® Tetra System (Bio-Rad, USA)
- 盖革计数器
- 移液枪
- 暗夹
实验步骤
- 预先在冰上配制kinase buffer (溶液配方1);
- 加入1-5 μg待测蛋白和1-5 μg MBP (检测待测蛋白是否具有自磷酸化活性时,不添加MBP) 至上述缓冲液中,使终体积为20 μl;
- 室温 (或置26 °C水浴中) 反应30 min;
- 加入5 μl 5x SDS-PAGE loading buffer (溶液配方2),75 °C加热5-10 min;
- 冷却至室温;
- 12% SDS-PAGE凝胶电泳分离,待染料线距离凝胶底部1-2 cm时停止电泳;
- 用塑料铲板将浓缩胶及染料线之下的凝胶 (包含染料线) 切下丢弃,剩余凝胶置于蒸馏水中漂洗掉表面的SDS,然后将凝胶置于滤纸上吸干水分,用保鲜膜将凝胶包好;
- 在暗室中进行下列操作:将已经用保鲜膜包好的凝胶置于暗夹中,用X-光片覆盖于凝胶上,扣好暗夹并将暗夹置于避光处 (如抽屉中) 3-5 h;
- 在暗室中将X-光片显影并定影,之后用考马斯亮蓝R-250染色液对凝胶染色并用脱色液脱色;
- 扫描或拍照X-光片及脱色后的凝胶,对结果进行分析。
注意事项
- 对于某些对特殊离子具有依赖性的蛋白激酶 (如钙离子依赖性蛋白激酶),应对kinase buffer中的成分进行调整。
- 对于某些对温度敏感的蛋白激酶,应调整步骤3中的反应温度。
- 步骤4中避免加热温度过高或时间过长,否则离心管盖容易冲开,造成管内液体飞溅,从而造成同位素污染事故。
- 放射性同位素操作应在规范的专用操作室内进行;含放射性同位素的废弃物 (废纸、废液等) 应按规定进行规范处理。
- 尽量避免待测蛋白在制备过程中活性受到损害。
溶液配方
- Kinase Buffer
50 mM Tris-HCl, pH 7.5
10 mM MgCl2
10 mM MnCl2
1 mM DTT
0.2 mM ATP
5 μCi [γ-32P]ATP
该缓冲液于冰上配制,现配现用,不可长久保存。
- 5x SDS-PAGE Loading Buffer
250 mM Tris-HCl, pH 6.8
10% (w/v) SDS
0.5% (w/v) BromopHenol Blue
50% (v/v) Glycerol
用前加入5% (v/v) β-巯基乙醇或50 mM DTT,加入β-巯基乙醇或DTT的loading buffer可在室温下放置一个月。
- 5x Tris-Glycine Buffer
0.125 M Tris
1.25 M Glysine
0.5% (w/v) SDS
- 考马斯亮蓝R-250染色液
0.1% (w/v) 考马斯亮蓝R-250
25% (v/v) 异丙醇
10% (v/v) 冰醋酸
- 脱色液
10% (v/v) 冰醋酸
5% (v/v) 乙醇
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