根癌农杆菌介导的粳稻遗传转化
Agrobacterium-mediated Genetic Transformation of Japonica Rice   

材料与试剂

1. 吸水纸
   
2. 滤纸
   
3. 无菌大平皿
   
4. 无菌小平皿
   
5. 粳稻种子
   
6. 根癌农杆菌工程菌株EHA105 (携带含目的基因载体)
   
7. 95%乙醇
   
8. 葡萄糖
   
9. 抗生素 (潮霉素、G418或除草剂Basta)
   
10. 封口胶
    
11. KT (Kinetin) (Sigma, catalog number: K-0753)
    
12. 6-BA (6-BenzylaminoPurine) (Sigma, catalog number: B-5898)
    
13. IAA (Indole-3-acetic acid) (Sigma, catalog number: I-5148)
    
14. NAA (Napthalene acetic acid) (Sigma, catalog number: N-0640)
    
15. 2,4-D (2,4-Dichlorophenoxyacetic acid) (Sigma, catalog number: D-8407)
    
16. CH (Casein Enzymatic Hydrolysate) (Sigma, catalog number: C-7290)
    
17. Kanamycin (USB, catalog number: 17924)
    
18. Cn (Carbenicillin) (GiBco BRL, catalog number: 10177-012)
    
19. Hn (hygromycin B) (GiBco BRL, catalog number: 10687-010)
    
20. AS (Acetosringone) (Aldrich chem., CO 01531 EG)
    
21. Pyridoxine HCl (Sigma, catalog number: P-8666)
    
22. Nicotinic acid (Sigma, catalog number: N-0765)
    
23. Inositol (Sigma, catalog number: I-3011)
    
24. Thiamine HCl (VB₁) (Sigma, catalog number: T-3902)
    
25. Phytagel HCl (VB₆) (Sigma, catalog number: P-8169)
    
26. Dimethyl Sulfoxide-DMSO (Sigma, catalog number: D-5879)
    
27. X-gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-galactoside) (Sigma, catalog number: B-3783)
    
28. NH₄NO₃
    
29. KH₂PO₄
    
30. KNO₃
    
31. MgSO₄·7H₂O
    
32. CaCl₂
    
33. CaCl₂·2H₂O
    
34. MnSO₄·4H₂O
    
35. ZnSO₄·7H₂O
    
36. KI
    
37. H₃BO₃
    
38. Na₂MoO₄·2H₂O
    
39. CoCl₂·6H₂O
    
40. CuSO₄·5H₂O
    
41. (NH₄)SO₄
    
42. MnSO₄·H₂O
    
43. FeSO₄·7H₂O
    
44. Na₂·EDTA·2H₂O
    
45. KCl
    
46. NaH₂PO₄
    
47. NaMoO₄·2H₂O
    
48. KOH
    
49. HgCl₂
    
50. Proline
    
51. Sucrose
    
52. MS_max储备液(10x) (见溶液配方)
    
53. MS_min储备液(100x) (见溶液配方)
    
54. N_6max储备液(10x) (见溶液配方)
    
55. N_6min储备液(100x) (见溶液配方)
    
56. Fe²⁺-EDTA储备液(100x) (见溶液配方)
    
57. Vitamin储备液(100x) (见溶液配方)
    
58. AA_max储备液(10x) (见溶液配方)
    
59. AA_min储备液(100x) (见溶液配方)
    
60. 6-BA储备液(1 mg/ml) (见溶液配方)
    
61. KT储备液(1 mg/ml) (见溶液配方)
    
62. 2,4-D储备液(1 mg/ml) (见溶液配方)
    
63. 100 mM AS储备液(见溶液配方)
    
64. IAA储备液(1 mg/ml) (见溶液配方)
    
65. NAA储备液(1 mg/ml) (见溶液配方)
    
66. 1 N KOH储备液 (见溶液配方)
    
67. 0.15% HgCl₂ (见溶液配方)
    
68. 诱导培养基 (见溶液配方)
    
69. 继代培养基 (见溶液配方)
    
70. 预培养基 (见溶液配方)
    
71. 共培养基 (见溶液配方)
    
72. 悬浮培养基 (见溶液配方)
    
73. 筛选培养基 (见溶液配方)
    
74. 分化培养基 (见溶液配方)
    
75. 生根培养基 (见溶液配方)
    注：以上所有常规试剂如NH₄NO₃, KH₂PO₄等都是由国药化工或光复化工公司提供。
    

仪器设备

1. 超净台
   
2. 100 ml、250 ml、500 ml三角瓶
   
3. 生根管
   
4. 枪形镊
   
5. 小铁勺
   
6. 酒精灯
   
7. 水洗杯
   
8. 剪刀
   
9. 28 °C摇床
   
10. 19 °C培养箱
    

实验步骤

注：本实验所有过程均需无菌操作。

1. 种子消毒及愈伤组织的诱导
   准备诱导培养基 (见溶液配方)，分装至100 ml的三角瓶中 (每瓶40-50 ml培养基)，封膜后121°C高温高压灭菌15 min，冷却备用。水稻种子去壳后先用75%乙醇清洗1 min (时间不能过长)，再用0.15% HgCl₂灭菌15-20 min，最后用无菌dH₂O洗涤4-5次。每瓶诱导培养基中接入8-12颗消毒处理后的水稻种子，30°C暗培养40-45 d诱导愈伤组织的产生 (图1A)。
   
2. 愈伤组织的继代
   2.1

   提前3 d配继代培养基 (见溶液配方)，每50 ml的三角瓶中分装25-30 ml培养基，封膜后121°C高温高压灭菌15 min，冷却备用。提前3 d配制可使培养基在使用时表面相对干燥，太湿的培养基不利于愈伤组织长。
   
   2.2

   从诱导的愈伤中挑选淡黄色、颗粒状、干燥、活力强的愈伤组织转入继代培养基中暗培养20 d；第一次继代时注意将愈伤组织上附着的其他组织如胚乳、芽等去除干净。继代一次的愈伤组织即可进行根癌农杆菌侵染，用于转化的愈伤最值最多继代两次。多次继代易使愈伤组织发生体细胞变异且降低转化效率) (图1B)。
3. 预培养 (如果时间比较紧，此步骤可省略)
   3.1

   提前用500 ml三角瓶准备适量无菌预培养的培养基 (见溶液配方)，封膜后高温高压灭菌12 min；使用前用微波炉熔解，待冷却至55°C左右，每250 ml培养基中加入300 μl AS和5 ml 50%葡萄糖后，摇匀倒8-10个皿。
   
   3.2

   从继代后的愈伤组织中，挑选淡黄色、颗粒状、干燥、活力强的愈伤组织组织转入预培养基中，每个皿接种60-80块绿豆大小的愈伤颗粒，愈伤颗粒较大可用镊子夹碎，28°C黑暗条件预培养3-4 d。
4. 侵染与共培养
   4.1

   实验前2 d，将含有目的基因的根癌农杆菌菌株在含有相应抗生素的LA平皿上划线，然后置于28°C培养2 d；准备悬浮培养基(100 ml/片段) (见溶液配方)及共培养培养基 (250 ml/片段) (见溶液配方)，封膜后121°C高温高压灭菌12 min。准备250 ml三角瓶若干、里面垫有多张吸水纸和滤纸大、小平皿，121°C高温高压灭菌30 min，使用前置于80°C烘干。
   
   4.2

   取出根癌农杆菌划线平皿，用接种环接入大约一环农杆菌(视悬浮培养基体积而定)于100 ml悬浮培养基中(见溶液配方)，加入100 μl AS和2 ml 50%葡萄糖，置于恒温摇床28 °C，200 rpm震荡培养30 min，农杆菌悬液浓度约为OD₆₀₀ =0.3即可(目测略有一些浑浊)。
   
   4.3

   农杆菌悬液震荡培养的同时，将继代的愈伤组织收集到250 ml无菌三角瓶中。
   
   4.4

   将4.3中制备好的农杆菌悬液倒入装有愈伤组织的三角瓶中直至浸没所有愈伤组织，静置10 min。
   
   4.5

   倒去菌液。取装有吸水纸和滤纸的灭菌小平皿，打开小平皿将装有愈伤的三角瓶倒置于小平皿的滤纸上，尽量沥尽菌液，再把愈伤展铺在无菌大皿的滤纸上，上面盖一张灭菌滤纸，用镊子轻压滤纸以吸干愈伤表面菌液，再抽去吸湿后的滤纸，如此上下各换四次滤纸，最后在愈伤上盖上一张滤纸，盖好大平皿，自然干燥1-2 h。
   注意：此步骤不建议打开平皿盖子吹干，因容易导致愈伤组织过度干燥而出现脱水现象。
   
   4.6

   在干燥愈伤组织的同时，微波炉加热熔解250 ml的共培养基，待冷却至55°C左右，加入300 μl AS和5 ml 50%葡萄糖溶液，摇匀后倒8-10个皿。
   
   4.7

   用镊子 (或勺子) 将干燥的愈伤颗粒转移到共培养基上 (愈伤转移到共培养基上后不要再挪动，减少培养基与愈伤表面的接触，防止农杆菌的过度生长)，封口胶封口。
   
   4.8

   置于19 °C黑暗条件下共培养3 d。
5. 水洗及筛选(S₁)
   5.1

   准备无菌蒸馏水、大、小平皿 (含有多张吸水纸和滤纸)、250 ml三角瓶若干，121°C高温高压灭菌30 min。大、小平皿灭菌后置于80 °C烘干。准备筛选培养基 (见溶液配方)，封膜后高温高压灭菌15 min。
   
   5.2

   将共培养后的愈伤组织转移至水洗杯中，倒入灭菌蒸馏水至完全侵没愈伤组织，盖上盖子振荡20-30 s，倒掉灭菌蒸馏水，如此水洗3-4次。加入灭菌蒸馏水至完全侵没愈伤组织，盖上盖子振荡20-30 s，静置 3-5 min，倒掉灭菌蒸馏水，如此水洗3-4次。进行观察，如果水洗杯内的蒸馏水澄清说明农杆菌已经基本清洗干净，否则需要继续水洗。最后倒掉灭菌蒸馏水，加入含500 mg/L Cn的灭菌蒸馏水，静置30 min。
   
   5.3

   倒去含500 mg/L Cn的灭菌蒸馏水，后续干燥愈伤的操作参考4.5。在干燥愈伤组织的同时，微波炉加热熔解250 ml筛选培养基，待冷却至55°C左右，加入400 μl CN、250 μl Hn和5 ml 50%葡萄糖，摇匀后倒8-10个皿。倒皿后应在超净工作台上打开皿盖，用无菌风吹1.5-2 h (筛选培养基表面不宜太湿，否则筛选时不利于农杆菌的抑制和抗性愈伤的生长)。
   
   5.4

   愈伤干燥后，用镊子将愈伤颗粒转移到筛选培养基 (建议接种密度20-25块愈伤/皿)，封口胶封口。
   
   5.5

   置于暗培养室筛选培养20 d (第一次筛选S₁) (图1C)。
6. 第二次筛选(S₂)
   6.1

   准备S₂阶段筛选培养基 (见溶液配方)，封膜后高温高压灭菌15 min；微波炉加热熔解250 ml筛选培养基，待冷却至55°C左右，依次加入300 μl CN、250 μl Hn、5 ml 50%葡萄糖，混匀后倒8-10个皿；倒皿后在超净工作台上打开皿盖，用无菌风吹1.5-2 h (筛选培养基表面不宜太湿，否则筛选时不利于农杆菌的抑制和抗性愈伤的生长)。
   
   6.2

   从S₁培养基上挑选干燥的、没有农杆菌污染的愈伤，转移到S₂培养基上(每皿接种20到35块愈伤)。
   
   6.3

   暗培养20 d，观察是否长出新鲜嫩黄的抗性愈伤，如果还没有抗性愈伤继续转皿进行S₃筛选培养(除培养基中加入的CN可适当减少（200 μl/250 ml）外，其余配置与灭菌方法同S₁和S₂)。一般粳稻品种经筛选两次即S₂阶段就能长出抗性愈伤 (图1D)。
7. 分化
   7.1

   提前3-4 d准备分化培养基 (见溶液配方)，100 ml三角瓶中加入40-50 ml分化培养基，封膜后121°C高温高压灭菌15 min。
   
   7.2

   挑取淡黄色、致密、干燥、生长旺盛的抗性愈伤小块，每一团只挑一个抗性愈伤 (因为来源于同一团的愈伤组织大多数情况下基因型一致)，注意不要挑到长有农杆菌的愈伤。每瓶分化培养基中均匀放置3-4小块抗性愈伤，因为愈伤组织细胞在分化培养基上会继续生长，放得太密容易导致不同的愈伤块长到一起无法区别 (图1E)。
   
   7.3

   光培养 (28°C、光照14 h/黑暗10 h) 30-40 d，待分化出幼苗有3-5 cm高后即可进行生根培养，光培养期间要及时把污染长菌的材料清理掉。
8. 生根
   8.1

   准备生根培养基 (见溶液配方)，向每根生根管中加入4-5 cm厚的培养基，封膜后121°C高温高压灭菌15 min。准备灭菌的空平皿4-5个。
   
   8.2

   用枪形镊将分化出的苗子从分化培养基中取出，置于灭过菌的空平皿中，一块愈伤只取1棵健壮的幼苗，用剪刀对幼苗进行清理（剪去死掉或发黄叶子以及分化培养基上长出的根），接入生根管内，每根管内接入1株幼苗 (图1F)。
   
   8.3

   光培养室生根培养15~20 d，待新根生长充分后，进行移栽。
9. 移栽
   9.1

   揭开生根管封口膜，加入一些自来水，光培养室中继续生长 (炼苗) 3-4 d。
   
   9.2

   炼苗期间可取叶片小样进行转基因阳性检测。
   
   9.3

   将转化幼苗从生根管中取出，洗净根上的附着培养基，移栽到准备好土的盆或桶中。 
   
   
   图1. 农杆菌转化过程

注意事项

1. 除移栽外全过程必须在无菌条件下操作，防止污染。
   
2. 污染的材料及时清理，以免扩大污染。
   
3. 尽量挑取生长状态好、活力强的愈伤组织进行试验。
   

溶液配方

一、溶液配制

1. MS_max储备液(10x)
   16.5 g NH₄NO₃
   1.7 g KH₂PO₄
   19.0 g KNO₃
   3.7 g MgSO₄·7H₂O
   3.32 g CaCl₂ or 4.4 g CaCl₂·2H₂O
   先加入三分之二体积的dH₂O，然后逐个溶解上述试剂，最后加入灭菌蒸馏水定容到1,000 ml，室温保存。
   
2. MS_min储备液(100x)
   2.23 g MnSO₄·4H₂O
   0.86 g ZnSO₄·7H₂O
   0.083 g KI
   0.62 g H₃BO₃
   0.025 g Na₂MoO₄·2H₂O
   0.0025 g CoCl₂·6H₂O
   0.0025 g CuSO₄·5H₂O
   加dH₂O定容到1,000 ml，室温保存
   注：Na₂MoO₄必须单独溶解，再与其它组分混合。
   
3. N_6max储备液(10x)
   28.3 g KNO₃
   4.63 g (NH₄)SO₄
   4.0 g KH₂PO₄
   1.85 g MgSO₄·7H₂O
   1.25 g CaCl₂ or 1.66 g CaCl₂·2H₂O
   先加入三分之二体积的dH₂O，然后逐个溶解上述试剂，最后加入灭菌蒸馏水定容到1,000 ml，室温保存。
   
4. N_6min储备液(100x)
   0.08 g KI
   0.16 g H₃BO₃
   0.15 g ZnSO₄·7H₂O
   0.44 g MnSO₄·4H₂O or 0.3335 g MnSO₄·H₂O
   用dH₂O定容到1,000 ml，室温保存。
   
5. Fe²⁺-EDTA储备液(100x)
   往一个试剂瓶中加入约300 ml dH₂O和2.78g FeSO₄·7H₂O；往另一试剂瓶中加入约300 ml dH₂O，并加热到70 °C，然后加入3.73 g Na₂·EDTA·2H₂O；都溶解好后，待溶液冷却至室温，将两个瓶中的溶液混合，然后加dH₂O定容到1,000 ml，4 °C避光保存。
   
6. Vitamin储备液(100x)
   0.1 g Nicotinic acid
   0.1 g Thiamine HCl(VB₁)
   0.1 g Pyridoxine HCl(VB₆)
   10 g Inositol
   0.2 g Glycine
   加dH₂O定容到1,000 ml，4 °C保存
   
7. AA_max储备液(10x)
   29.50 g KCl
   2.50 g MgSO₄·7H₂O
   1.50 g NaH₂PO₄
   1.50 g CaCl₂·2H₂O
   加dH₂O定容到1,000 ml，室温避光保存
   
8. AA_min储备液(100x)
   1.0 g MnSO₄·H₂O
   0.2 g ZnSO₄·7H₂O
   0.0025 g CuSO₄·5H₂O
   0.3 g H₃BO₃
   0.075 g KI
   0.0025 g CoCl₂·6H₂O
   0.025 g NaMoO₄·2H₂O
   加dH₂O定容到1,000 ml，室温避光保存
   注：Na₂MoO₄必须单独溶解，再与其它组分混合。
   
9. 6-BA储备液(1 mg/ml)
   100 mg 6-BA
   加入1.0 ml 1N KOH振摇至6-BA溶解，然后加dH₂O定容到100 ml，室温保存。
   
10. KT储备液(1 mg/ml)
    100 mg KT
    加入1.0 ml 1N KOH振摇至KT溶解，然后加dH₂O定容到100 ml，室温保存。
    
11. 2,4-D储备液(1 mg/ml)
    100 mg 2,4-D
    加入1.0 ml 1N KOH 振摇5 min，然后加10 ml dH₂O 并振摇至2,4-D溶解，用dH₂O定容到100 ml，室温保存。
    
12. 100 mM AS储备液
    0.196 g AS
    10 ml DMSO
    用1.5 ml离心管分装，4 °C保存。
    
13. IAA储备液(1 mg/ml)
    100 mg IAA
    加入1.0 ml 1N KOH 振摇至IAA溶解
    然后用dH₂O定容到100 ml，室温避光保存。
    
14. NAA储备液(1 mg/ml)
    100 mg NAA
    加入1.0 ml 1N KOH振摇至NAA溶解，再用dH₂O定容到100 ml，室温避光保存。
    
15. 1N KOH储备液
    5.6 g KOH
    用100 ml dH₂O溶解，室温保存。
    
16. 0.15%HgCl₂
    1.5 g HgCl₂
    先用1ml无水乙醇部分或完全溶解
    再用dH₂O定容至1,000 ml，搅拌4-8 h，室温妥善保存。
    注：升汞有剧毒。
    
    

注：所有培养基都必须在使用前准备。

1. 诱导培养基

   N6max储备液(10x)	100 ml
   N6min储备液(100x)	10 ml
   Vitamin(100x)	10 ml
   Fe2+-EDTA储备液(100x)	10 ml
   2,4-D储备液(1 mg/ml)	2.5 ml
   CH	0.6 g
   Proline	0.3 g
   Sucrose	30 g
   Phytagel	3 g

   调pH值至5.9，补dH₂O至1,000 ml
   
2. 继代培养基
   

   N6max储备液(10x)	100 ml
   N6min储备液(100x)	10 ml
   Vitamin(100x)	10 ml
   Fe2+-EDTA储备液(100x)	10 ml
   2,4-D储备液(1 mg/ml)	2.0 ml
   CH	0.6 g
   Proline	0.5 g
   Sucrose	30 g
   Phytagel	3 g

   调pH值至5.9，补dH₂O至1,000 ml
   
3. 预培养基

   N6max储备液(10x)	12.5 ml
   N6min储备液(100x)	1.25 ml
   Vitamin(100x)	2.5 ml
   Fe2+-EDTA储备液(100x)	25 ml
   2,4-D储备液(1 mg/ml)	0.75 ml
   CH	0.15 g
   Sucrose	5 g
   Agarose	1.75 g

   调pH值至5.4，补dH₂O至250 ml
   
4. 共培养基

   N6max储备液(10x)	12.5 ml
   N6min储备液(100x)	1.25 ml
   Vitamin(100x)	2.5 ml
   Fe2+-EDTA储备液(100x)	25 ml
   2,4-D储备液(1 mg/ml)	0.75 ml
   CH	0.2 g
   Sucrose	5 g
   Agarose	1.75 g

   调pH值至5.4，补dH₂O至250 ml
   
5. 悬浮培养基

   N6max储备液(10x)	5 ml
   N6min储备液(100x)	0.5 ml
   Vitamin(100x)	1 ml
   Fe2+-EDTA储备液(100x)	0.5 ml
   2,4-D储备液(1 mg/ml)	0.2 ml
   CH	0.08 g
   Sucrose	2 g

   调pH值至5.4，补dH₂O至100 ml
   
6. 筛选培养基

   N6max储备液(10x)	25 ml
   N6min储备液(100x)	2.5 ml
   Vitamin(100x)	2.5 ml
   Fe2+-EDTA储备液(100x)	2.5 ml
   2,4-D储备液(1 mg/ml)	0.625 ml
   CH	0.15 g
   Sucrose	7.5 g
   Agarose	1.75 g

   调pH值至6.0，补dH₂O至250 ml
   
7. 分化培养基

   MSmax储备液(10x)	100 ml
   MSmin储备液(100x)	10 ml
   Vitamin(100x)	10 ml
   Fe2+-EDTA储备液(100x)	10 ml
   6-BA	2.0 ml
   KT	2.0 ml
   IAA	0.2 ml
   NAA	0.2 ml
   Sucrose	30 g
   CH	1 g
   Phytagel	3 g

   调pH值至6.0，补dH₂O至1,000 ml
   
8. 生根培养基

   MSmax储备液(10x)	50 ml
   MSmin储备液(100x)	5 ml
   Vitamin(100x)	10 ml
   Fe2+-EDTA储备液(100x)	10 ml
   Sucrose	20 g
   Phytagel	3 g

   调pH值至5.8，补dH₂O至1,000 ml