实验原理:农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌,它能在一定条件下趋化性地感染植物的受伤部位,并诱导产生冠瘿瘤或发状根。根癌农杆菌和发根农杆菌细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒,它们都含有一段可转移的DNA(T-DNA),农杆菌通过侵染植物伤口,可以将T-DNA插入到植物基因组中,并且稳定的遗传给后代。本实验是把目的基因装载到经过改造的Ti质粒的T-DNA区,借助农杆菌的感染实现外源基因向水稻愈伤的转移与整合,然后通过组织培养技术,再生出转化植株。
实验目的:通过农杆菌介导的遗传转化把目的基因导入到籼稻品种中(MH63,ZS97,9311等)。
关键词: 籼稻, 根癌农杆菌, 遗传转化
材料与试剂
- 吸水纸
- 滤纸
- 大培养皿
- 小培养皿
- 封口膜
- Parafilm
- 接种环
- 籼稻种子
- EHA105农杆菌 (携带含目的基因载体)
- 乙醇
- 6-Benzylaminopurine (6-BA) (Sigma, catalog number: B-3408)
- Kinetin (KT) (Sigma, catalog number: K-0753)
- Naphthalene acetic acid (NAA) (Sigma, catalog number: N-0640)
- Indole-3-acetic acid (IAA) (Sigma, catalog number: I-2886)
- 2, 4-Dichlorophenoxyacetic acid (2, 4-D) (Sigma, catalog number: D-7299)
- Kanamycin (USB, catalog number: 17924)
- Casein Enzymatic Hydrolysate (CH) (Sigma, catalog number: N-4642)
- Carbenicillin (Cn) (Bio Basic INC., catalog number: CDJ469)
- Hygromycin B (Hn) (Roche, catalog number: 10843555001)
- Nicotinic acid (Sigma, catalog number: N-0765)
- Pyridoxine HCl (VB6) (Sigma, catalog number: P-8666)
- Thiamine HCl (VB1) (Sigma, catalog number: T-3902)
- Inositol (Sigma, catalog number: I-3011)
- Phytagel (Sigma, catalog number: P-8169)
- Dimethyl Sulfoxide (DMSO) (Sigma, catalog number: D-5879)
- Acetosringone (AS) (Aldrich chem., CO 01531 EG)
- Proline
- Sucrose
- Agar powder
- D-sorbitol
- NH4NO3
- KNO3
- KH2PO4
- MgSO4∙7H2O
- CaCl2
- CaCl2∙2H2O
- MnSO4∙4H2O
- ZnSO4∙7H2O
- H3BO3
- KI
- Na2MoO4∙2H2O
- CoCl2∙6H2O
- CuSO4∙5H2O
- (NH4)2SO4
- FeSO4∙7H2O
- Na2 EDTA∙2H2O
- Glycine
- KOH
- HgCl2
- Glucose
- MSmax储备液(10x) (见溶液配方)
- MSmin储备液(100x) (见溶液配方)
- N6max储备液(10x) (见溶液配方)
- N6min储备液(100x) (见溶液配方)
- Fe2+-EDTA储备液(100x) (见溶液配方)
- Vitamin储备液(100x) (见溶液配方)
- 6-BA储备液(1 mg/ml) (见溶液配方)
- KT储备液(1 mg/ml) (见溶液配方)
- 2, 4-D储备液(1 mg/ml) (见溶液配方)
- IAA储备液(1 mg/ml) (见溶液配方)
- NAA储备液(1 mg/ml) (见溶液配方)
- 200 mM AS储备液(见溶液配方)
- 1 N KOH储备液(见溶液配方)
- 0.15% HgCl2 (见溶液配方)
- 50%葡萄糖(见溶液配方)
- 250 mg/ml CN (见溶液配方)
- 50 mg/ml Kan (见溶液配方)
- 诱导培养基(见溶液配方)
- 继代培养基(见溶液配方)
- 预培养基(见溶液配方)
- 悬浮培养基(见溶液配方)
- 共培养基(见溶液配方)
- 筛选培养基(见溶液配方)
- 预分化培养基(见溶液配方)
- 分化培养基(见溶液配方)
- 生根培养基(见溶液配方)
注:以上所有常规试剂都是由国药化工和光复科技提供。
仪器设备
- 超净工作台
- 100 ml三角瓶
- 250 ml三角瓶
- 500 ml三角瓶
- 生根管
- 剪刀
- 镊子
- 小铁勺
- 酒精灯
- 28 °C摇床
- 19 °C培养箱
实验步骤
- 诱导愈伤
- 继代
- 预培养
- 侵染
- 水洗与筛选
- 第二次筛选(S2)
- 分化
- 生根
准备装有1/4生根培养基(见溶液配方)的生根管。从分化培养基中挑出幼苗 (同一块愈伤组织若分化出多株幼苗,则挑选长势最好的一株),用灭菌的剪刀剪去老根和周围附着的愈伤,然后接入生根管内,28 °C、光照14 h/黑暗10 h培养10~20 d (根据幼苗大小决定生长时间)。
- 炼苗与移栽
生根完成后开盖,加入自来水继续培养3 d,然后取出再生植株用水洗掉生根培养基,修剪根部和叶部,移栽到温室。
注意事项
- 整套过程必须在无菌条件下操作,尽量做到少污染。
- 污染的材料要求及时清理,以免扩大污染。
- 尽量挑取活力强的愈伤进行试验。
- 在整个转化过程中,愈伤组织或者分化后的幼苗长至适当状态,应当尽快进行下一步操作 (尽量减少组织培养时间可减少体细胞突变)。
溶液配方
一、溶液配置
- MSmax储备液(10x)
NH4NO3
| 16.5 g
|
KNO3
| 19.0 g
|
KH2PO4
| 1.7 g
|
MgSO4·7H2O
| 3.7 g
|
CaCl2
| 3.32 g or CaCl2∙2H2O 4.4 g
|
逐个溶解,然后加蒸馏水定容至1 L。
- MSmin储备液(100x)
MnSO4·4H2O
| 2.23 g
|
ZnSO4·7H2O
| 0.86 g
|
H3BO3
| 0.62 g
|
KI
| 0.083 g
|
Na2MoO4·2H2O
| 0.025 g
|
CoCl2·6H2O
| 0.0025 g
|
CuSO4·5H2O
| 0.0025 g
|
注:Na2MoO4·2H2O必须单独溶解,再与其它组分混合,加蒸馏水定容到1 L,室温保存。
- N6max储备液(10x)
KNO3
| 28.3 g
|
KH2PO4
| 4.0 g
|
(NH4)2SO4
| 4.63 g
|
MgSO4∙7H2O
| 1.85 g
|
CaCl2
| 1.25 g or CaCl2∙2H2O 1.66 g
|
逐个溶解,然后加蒸馏水定容到1 L。
- 继代A储备液(10x)
NH4NO3
| 17 g
|
KNO3
| 19.0 g
|
KH2PO4
| 1.7 g
|
MgSO4·7H2O
| 3.7 g
|
CaCl2
| 3.02 g or CaCl2∙2H2O 4 g
|
逐个溶解,然后加蒸馏水定容至1 L。
- 继代B储备液(100x)
MnSO4·4H2O
| 10 g
|
ZnSO4·7H2O
| 2 g
|
H3BO3
| 3 g
|
KI
| 0.75 g
|
Na2MoO4·2H2O
| 0.25 g
|
CoCl2·6H2O
| 0.025 g
|
CuSO4·5H2O
| 0.025 g
|
注:Na2MoO4·2H2O必须单独溶解,再与其它组分混合,加蒸馏水定容至1 L,4°C保存。
- Fe2+-EDTA储备液(100x)
在一个试剂瓶中加入300 ml蒸馏水,然后加入在另一试剂瓶中加入300 ml蒸馏水,并加热到70 °C,然后加入都溶解好后,将两个试剂瓶中的溶液混合,70 °C保温2 h,然后加入蒸馏水定容至1 L,4 °C避光保存。
- Vitamin储备液(100x)
Nicotinic acid
| 0.1 g
|
Pyridoxine HCl (VB6)
| 0.1 g
|
Thiamine HCl (VB1)
| 0.1 g
|
Glycine
| 0.2 g
|
Inositol
| 10 g
|
加蒸馏水定容到1 L,4 °C避光保存。
- AAmax储备液(10x)
KCl
| 29.5 g
|
MgSO4·7H2O
| 2.5 g
|
NaH2PO4
| 1.5 g
|
CaCl2∙2H2O
| 1.5 g
|
加蒸馏水定容到1 L,室温避光保存。
- AAmin储备液(100x)
MnSO4∙H2O
| 1.0 g
|
H3BO3
| 0.3 g
|
ZnSO4∙7H2O
| 0.2 g
|
KI
| 0.075 g
|
Na2MoO4∙2H2O
| 0.025 g
|
CuSO4∙5H2O
| 0.0025 g
|
CoCl2∙6H2O
| 0.0025 g
|
注:Na2MoO4单独溶解,然后与其它组分混合并加蒸馏水定容至1 L,室温避光保存。
- 6-BA储备液(1 mg/ml)加入1.0 ml 1 N KOH搅拌至6-BA完全溶解,然后加蒸馏水定容到100 ml,室温保存。
- KT储备液(1 mg/ml)加入1.0 ml 1 N KOH搅拌至KT完全溶解,然后加蒸馏水定容到100 ml,室温保存。
- 2, 4-D储备液(1 mg/ml)加入1.0 ml 1N KOH搅拌5 min,然后加10 ml蒸馏水搅拌至2,4-D完全溶解,用蒸馏水定容至100 ml,室温保存。
- IAA储备液(1 mg/ml)加入1.0 ml 1N KOH搅拌至IAA完全溶解,然后用蒸馏水定容至100 ml,室温避光保存。
- NAA储备液(1 mg/ml)加入1.0 ml 1N KOH搅拌至NAA完全溶解,然后用蒸馏水定容到100 ml,室温避光保存。
- 100 mM AS储备液用1.5 ml离心管分装,4 °C保存。
- 1 N KOH储备液用100 ml蒸馏水溶解,室温保存。
- 0.15% HgCl2 先加600 ml蒸馏水完全溶解,再加入100 μl吐温20,然后用蒸馏水定容至1 L。
- 50%葡萄糖加蒸馏水溶解后定容至50 ml,高压灭菌后4 °C保存。
- Carbenicillin (Cn)加ddH2O定容至4 ml,分装至1.5 ml离心管,-20 °C保存。
二、培养基配置 - 诱导培养基
MSmax储备液(10x)
| 100 ml
|
MSmin储备液(100x)
| 10 ml
|
Fe2+-EDTA储备液(100x)
| 10 ml
|
Vitamin储备液(100x)
| 10 ml
|
2, 4-D储备液
| 2.5 ml
|
Proline
| 0.5 g
|
Glutamine
| 0.5 g
|
Casein Enzymatic Hydrolysate
| 0.6 g
|
Sucrose
| 30 g
|
Phytagel
| 3 g
|
先加入900 mL蒸馏水,用1 N KOH调至pH值为6.0,加蒸馏水定容至1 L,然后煮沸分装至100 ml三角瓶,高压灭菌。
- 继代培养基
继代A储备液(10x)
| 100 ml
|
继代B储备液(100x)
| 10 ml
|
Fe2+-EDTA储备液(100x)
| 10 ml
|
Vitamin储备液(100x)
| 10 ml
|
2, 4-D储备液
| 3.0 ml
|
Proline
| 0.6 g
|
Glutamine
| 0.5 g
|
Casein Enzymatic Hydrolysate
| 0.8 g
|
Maltose
| 30 g
|
Phytagel
| 3.0 g
|
先加入900 ml蒸馏水,用1 N KOH调至pH值为6.0,加蒸馏水定容至1 L,然后煮沸分装至100 ml三角瓶,高压灭菌。
- 预培养基
MSmax储备液(10x)
| 12.5 ml
|
MSmin储备液(100x)
| 1.25 ml
|
Fe2+-EDTA储备液(100x)
| 1.25 ml
|
Vitamin储备液(100x)
| 1.25 ml
|
2, 4-D储备液
| 0.75 ml
|
Maltose
| 5.0 g
|
Agarose
| 1.75 g
|
先加入200 ml蒸馏水,用1 N KOH调至pH值为5.6,加蒸馏水定容至250 ml,高压灭菌。使用之前加入5 ml 50%葡萄糖与250 μl AS储备液。
- 悬浮培养基
AAmax储备液(10x)
| 10 ml
|
AAmin储备液(100x)
| 1 ml
|
Fe2+-EDTA储备液(100x)
| 1 ml
|
Vitamin储备液(100x)
| 1 ml
|
2, 4-D储备液
| 0.2 ml
|
Glutamine
| 0.0876 g
|
Asparagine
| 0.0216 g
|
Arginine
| 0.0176 g
|
Maltose
| 2 g
|
Glucose
| 1 g
|
用1 N KOH调至pH值为5.4,加蒸馏水定容至100 ml,高压灭菌,使用时加入100 μl AS储备液。
- 共培养基
MSmax储备液(10x)
| 6.25 ml
|
MSmin储备液(100x)
| 1.25 ml
|
Fe2+-EDTA储备液(100x)
| 2.5 ml
|
Vitamin储备液(100x)
| 2.5 ml
|
2, 4-D储备液
| 0.75 ml
|
Casein Enzymatic Hydrolysate
| 0.2 g
|
Maltose
| 5.0 g
|
Agarose
| 1.75 g
|
先加入200 ml蒸馏水,用1 N KOH调至pH值为5.4,加蒸馏水定容至250 ml,高压灭菌。使用之前加入5 ml 50%葡萄糖与250 μl AS储备液。
- 筛选培养基
继代A储备液(10x)
| 25 ml
|
继代B储备液(100x)
| 2.5 ml
|
Fe2+-EDTA储备液(100x)
| 2.5 ml
|
Vitamin储备液(100x)
| 2.5 ml
|
2, 4-D储备液
| 0.625 ml
|
Proline
| 0.15 g
|
Glutamine
| 0.1 g
|
Casein Enzymatic Hydrolysate
| 0.15 g
|
Maltose
| 7.5 g
|
Agarose
| 1.75 g
|
先加入200 ml蒸馏水,用1 N KOH调至pH值为6.0,加蒸馏水定容至250 ml,高压灭菌。
- 预分化培养基
N6max储备液(10x)
| 25 ml
|
继代B储备液(100x)
| 2.5 ml
|
Fe2+-EDTA储备液(100x)
| 2.5 ml
|
Vitamin储备液(100x)
| 2.5 ml
|
6-BA储备液
| 0.5 ml
|
KT储备液
| 0.5 ml
|
NAA储备液
| 50 μl
|
IAA储备液
| 50 μl
|
Proline
| 0.15 g
|
Casein Enzymatic Hydrolysate
| 0.15 g
|
Maltose
| 5.0 g
|
Sucrose
| 2.5 g |
Agarose
| 1.75 g
|
先加入200 ml蒸馏水,用1 N KOH调至pH值为5.9,加蒸馏水定容至250 ml,高压灭菌。
- 分化培养基
N6max储备液(10x)
| 100 ml
|
继代B储备液(100x)
| 6 ml
|
Fe2+-EDTA储备液(100x)10 | ml
|
Vitamin储备液(100x)
| 10 ml
|
6-BA储备液 | 2.0 ml
|
KT储备液
| 2.0 ml
|
IAA储备液 | 0.2 ml
|
NAA储备液 | 0.2 ml
|
Proline
| 0.6 g
|
Casein Enzymatic Hydrolysate | 1 g
|
Maltose
| 20 g
|
Sucrose
| 10 g |
Agarose | 3.0 g
|
先加入900 ml蒸馏水,用1 N KOH调至pH值为6.0,补蒸馏水定容至1 L,然后煮沸分装至100 ml三角瓶,高压灭菌。
- 生根培养基
MSmax储备液(10x)
| 50 ml
|
MSmin储备液(100x)
| 5 ml
|
Fe2+-EDTA储备液(100x)
| 10 ml
|
Vitamin储备液(100x)
| 10 ml
|
Sucrose
| 20 g
|
Phytagel
| 3 g
|
先加入900 ml蒸馏水,用1 N KOH调至pH值为5.8,加蒸馏水定容至1 L,然后煮沸分装至生根管,高压灭菌。
Copyright: © 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:刘瑜, 凌飞, 林拥军, 陈浩. (2018). 农杆菌介导的籼稻遗传转化.
Bio-101: e1010175. DOI:
10.21769/BioProtoc.1010175.
How to cite: Liu, Y., Ling, F., Lin, Y. J. and Chen, H. (2018). Agrobacterium-mediated Transformation of Indica Rice.
Bio-101: e1010175. DOI:
10.21769/BioProtoc.1010175.