实验原理:Toki等(2006)发现,水稻成熟胚在诱导愈伤1 d后可以被农杆菌侵染,诱导愈伤5 d后可以被高效转化。Toki (1997)研究表明在32 °C、光照条件下,水稻愈伤组织可以快速分裂。在该条件下进行筛选培养,14 d可以得到明显的抗性愈伤组织。本实验的目的是在实验室已有的遗传转化方法基础上,参考Toki等(1997, 2006)发表的部分实验参数,建立快速的水稻转化方法,以缩短遗传转化周期。本实验在32 °C、光照条件下诱导愈伤,对诱导5 d的水稻愈伤组织进行侵染,随后在32 °C、光照条件下以潮霉素作为筛选剂进行筛选培养,14 d后获得了抗性愈伤组织,对抗性愈伤组织进行分化培养,获得稳定的转化植株。从愈伤组织诱导到转化再生植株生根,整个实验周期约为50 d。
关键词: 水稻成熟胚, 农杆菌介导, 快速转化
材料与试剂
仪器设备
实验步骤
实验结果
成熟水稻种子接种到诱导培养基5-10 d后,有明显的愈伤组织形成 (图1a、1b);用农杆菌 (含有潮霉素抗性基因hpt和gfp表达框架) 对愈伤组织进行侵染,共培养3 d后,将愈伤组织接种到含有50 mg/L潮霉素的筛选培养基上,14 d后可以观察到新生愈伤组织,用荧光体视显微镜进一步观察,新生愈伤组织产生明显的绿色荧光信号,说明gfp基因整合到了水稻基因组 (图1c、1d);将抗性愈伤组织接种到分化培养基,21 d左右有再生植株形成,用荧光体视显微镜进一步观察,转化再生植株有绿色荧光信号,说明gfp基因在转化再生植株中稳定表达(图1e、1f)。采用本实验中的快速转化方法,可以在50 d左右获得转化再生植株,相比先前的转化方法 (需要120 d左右) 遗传转化周期大大缩短。 图1. 农杆菌介导水稻快速转化。a和b分别为诱导5 d和10 d的水稻愈伤组织;c和d为筛选培养14 d形成的抗性愈伤组织;e和f为分化培养21 d形成的再生植株。
注意事项
溶液配方
一、培养基相关母液
二、培养基的配制
参考文献
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我们在文中说的是“通过调整培养基也可以用于籼稻材料的遗传转化”,而不是“通过调整培养基本方法”。简单说,就是粳稻培养一般通用N6培养基,但这个培养基不适合大多数籼稻培养。我们实验室有尝试改良一些籼稻用培养基,但是也只适用于少数几个籼稻。我们认为籼稻目前仍缺乏通用的培养基。
感谢陈老师的答复!目前商业化的培养基,有用于籼稻转化效率相对高的么?谢谢。